Bases genètiques de la conductaMètodes i tècniques en genètica de la conducta
-
Mario Ezquerra Trabalon
Doctor en Biologia per la UB. Investigador del Sistema Nacional de Salut, al Laboratori de Neurologia Experimental de la Fundació Clínica de Barcelona. Les seves línies d'investigació se centren en l'estudi de factors genètics i patrons d'expressió gènica associats a diferents parkinsonismes.
-
David Gallardo-Pujol
Llicenciat en Psicologia per la UAB i doctor en Psicologia per la UB i investigador al Departament de Personalitat, Avaluació i Tractament Psicològic de la UB. Les seves línies de recerca giren entorn del comportament antisocial i de l'estudi experimental de les interaccions entre factors genètics i ambientals en el desenvolupament de la personalitat.
-
Sunsi Martí Carbonell
Llicenciada en Ciències Biològiques per la UB. Doctora en Biologia per la UAB. Professora titular de Psicobiologia i Metodologia de les Ciències de la Salut de la Facultat de Psicologia de la UAB. La seva activitat investigadora se centra en l'estudi de les bases neuroendocrines de la conducta.
-
Noemí Robles Muñoz
Llicenciada en Psicologia per la UAB. Màster en Neurociència i doctora en Psicologia per la UAB. Actualment, és professora de la UAB i consultora dels Estudis de Psicologia de la UOC.
PID_00215661
Cap part d'aquesta publicació, incloent-hi el disseny general i la coberta, no
pot ser copiada,
reproduïda, emmagatzemada o transmesa de cap manera ni per cap mitjà, tant si
és elèctric com
químic, mecànic, òptic, de gravació, de fotocòpia o per altres mètodes, sense
l'autorització
prèvia per escrit dels titulars del copyright.
Índex
- Introducció
- Objectius
- 1.Mètodes estadístics
- 1.1.Continguts
- 1.2.El model biomètric de descomposició de la variància
- 1.3.Dissenys i mètodes de recerca
- 1.3.1.Estudis de bessons
- 1.3.2.Estudis de famílies
- 1.3.3.Anàlisi d'extrems
- 1.3.4.Cartografia de QTL i estudis de lligament
- 1.3.5.Estudis d'associació
- 1.4.Errors que s'han d'evitar en la interpretació d'estudis en genètica del comportament
- 2.Mètodes i tècniques de laboratori
- 2.1.Conceptes generals
- 2.2.Hibridació d'àcids nucleics
- 2.2.1.Southern blot
- 2.2.2.Northern blot
- 2.3.Mètodes de genotipatge de l'ADN
- 2.3.1.Seqüenciació d'ADN
- 2.3.2.Anàlisi de conformació de cadena senzilla (SSCP)
- 2.3.3.Anàlisi d'heterodúplex
- 2.3.4.Determinació de polimorfismes mitjançant anàlisi de restricció (PCR-RFLP)
- 2.3.5.Amplificació múltiple (PCR múltiplex)
- 2.3.6.Amplificació múltiple dependent de lligació de la sonda
- 2.3.7.Determinació de polimorfismes microsatèl·lits
- 2.3.8.Genotipatge mitjançant sondes TaqMan
- 2.3.9.Xips d'ADN per a genotipatge a gran escala
- 2.4.Estudis d'expressió gènica
- 2.5.Mètodes d'estudi de modificacions epigenètiques. Metilació de l'ADN
- 3.Mètodes d'estudi en models animals
- Exercicis d'autoavaluació
- Bibliografia
Introducció
En les pàgines que vénen a continuació, veurem diversos aspectes dels mètodes de recerca
en humans i en models animals en genètica del comportament. D'una banda, introduirem
l'estudi de la variabilitat d'un tret o característica en una població com a font
d'informació genètica. De l'altra, presentarem un model clàssic en genètica del comportament
que encara s'utilitza amb freqüència, encara que amb algunes variants, el model biomètric,
i una derivació d'aquest, el model psicomètric. Una vegada presentats els conceptes
clau en el punt anterior, veurem com es relacionen els gens i l'ambient entre ells
i quines implicacions tenen les diferents formes de relació en el desenvolupament
ontogenètic del comportament.
Així, farem una breu revisió dels estudis de bessons, els estudis d'adopcions i famílies,
l'anàlisi d'extrems, la cartografia de loci de trets quantitatius (QTL, en llengua anglesa) i els estudis d'associació.
En segon lloc, es descriuran les principals tècniques de laboratori i mètodes aplicats
en el camp de la genètica humana.
Finalment, es farà una descripció breu dels principals models animals utilitzats en
psicogenètica.
Objectius
-
Conèixer i comprendre l'estudi de les diferències individuals amb relació a la variació en l'ADN.
-
Conèixer les tècniques clàssiques utilitzades en genètica de la conducta en humans.
-
Entendre les diferents formes de correlació i interacció entre gens i ambient amb relació al comportament.
-
Conèixer les principals tècniques de laboratori i les aproximacions metodològiques més importants en el camp de la genètica humana.
-
Conèixer els models animals més utilitzats en psicogenètica.
1.Mètodes estadístics
1.1.Continguts
Totes les persones som diferents, però totes tenim coses en comú. Aquesta afirmació,
que pot semblar tan senzilla, ha originat dècades de recerca en psicologia diferencial.
Tradicionalment, les neurociències s'han ocupat d'investigar universals, és a dir,
allò que sigui aplicable a tota una espècie, o a tota una classe. Tanmateix, s'han
ocupat poc de la variació intraespecífica. Això planteja problemes en moltes àrees
de la psicologia. Per exemple, per què uns nens tenen dificultats per a aprendre a
llegir i d'altres no? O per què hi ha persones que pateixen depressió i d'altres que
han sofert les mateixes adversitats no la pateixen? La resposta a aquestes preguntes
rau en l'estudi de les diferències individuals.
Precisament, comprendre les diferències individuals i l'origen d'aquestes ens pot
ajudar a intervenir-hi o explicar-les.
Mitjançant l'estudi de la variabilitat o la variància, amb dades genètiques, podem
descompondre les fonts de variació (Plomin, DeFries, Craig i McGuffin, 2002).
Així, encara que el debat entre naturalesa i ambient sembla interminable (Bouchard i McGue, 2002), els investigadors en genètica del comportament
estan arribant a un acord més o menys consensual sobre la influència de la naturalesa,
de l'ambient i, especialment, de la naturalesa via ambient (nature via nurture).
Al llarg del mòdul, anirem veient diferents aproximacions metodològiques a la genètica del comportament, des d'un enfocament més molar, més generalista, que estudia tant les influències
ambientals com les genètiques, a estudis centrats en la localització de regions en
el genoma relacionades amb un tret (estudis de lligament i QTL), per després posar
a prova l'associació de gens candidats d'aquestes regions en els estudis d'associació.
D'altra banda, encara que no és l'objectiu d'aquest text, la recerca en genètica del
comportament també ha de servir-se del descobriment de factors de risc ambientals,
ja que poden afectar diferencialment l'expressió d'alguns gens (interaccions GxE).
En la figura, es pot veure un esquema dels diferents tipus d'aproximacions metodològiques
a la genètica del comportament. De dalt a baix, s'incrementa el detall d'anàlisi,
des d'una aproximació més molar a una més molecular. La part dreta correspon a la
línia de recerca sobre factors ambientals, mentre que l'esquerra es correspon al nivell
genètic. Ambdues línies conflueixen en l'estudi de les interaccions entre genotip
i ambient.
1.2.El model biomètric de descomposició de la variància
1.2.1.Introducció i concepte d'heretabilitat i ambientalitat
Sir Francis Galton, en el seu llibre Hereditary genius: an inquiry into its laws and consequences ('El geni hereditari: una investigació de les seves lleis i conseqüències', 1892)
va ser el primer que va investigar, científicament, les causes genètiques i ambientals
de les diferències individuals en humans.
La seva proposició bàsica era que si un tret és determinat genèticament, com més propers
siguin dos parents, més similars hauran de ser per a aquest tret.
Anys després, Ronald Fisher va oferir la primera explicació matemàtica de com les
correlacions entre familiars es podien explicar a partir de l'herència mendeliana
(Neale i Maes, en premsa). La seva contribució principal va ser el desenvolupament
del concepte de la versemblança, imprescindible per als avenços que vindrien després i que és utilitzada encara avui.
El concepte de versemblança
El concepte de versemblança, i la seva utilització en models de genètica quantitativa
mitjançant el mètode d'estimació de màxima versemblança (MLE, en anglès, i àmpliament
utilitzat), es basa en els treballs de Ronald Fisher. Vegem de què es tracta.
Per començar, podem considerar que la probabilitat d'un esdeveniment X que depèn d'uns paràmetres p es pot escriure com a:
Llavors, la versemblança seria:
És a dir, seria la versemblança dels paràmetres obtinguts des de les dades. En altres
paraules, quan parlem de probabilitat, coneixem els valors dels paràmetres (amb una
probabilitat determinada, per exemple, obtenir creu quan llancem una moneda a l'aire)
i intentem predir un resultat. En el cas de la versemblança, primer tenim les dades
i, després, estimem els paràmetres.
En el mètode d'estimació de màxima versemblança, la consigna és trobar els valors
dels paràmetres que volem estimar que facin les dades observades tan versemblants
com sigui possible, mitjançant múltiples iteracions.
En el cas de la genètica quantitativa, és important perquè ens permet estimar els
paràmetres que ens interessen, és a dir, l'heretabilitat i l'ambientalitat, a partir
d'observacions de les dades, que en el nostre cas són parelles de bessons.
Tanmateix, val la pena destacar que el mètode MLE no és l'únic d'estimació disponible.
El mètode MLE és ideal per a dades contínues i distribuïdes de forma normal, però
en psicologia i ciències afins, de vegades ens trobem amb tipus de dades que no segueixen
aquesta distribució, i llavors s'han d'usar altres mètodes, com per exemple el mètode
de mínims quadrats no ponderats (García-Forero, 2006).
Així doncs, la determinació de la importància relativa dels gens i l'ambient s'aconsegueix
mitjançant l'ajustament de diferents models estadístics que veurem més endavant; tanmateix,
per a entendre'ls, abans hem de presentar dos conceptes que són clau, l'heretabilitat i l'ambientalitat.
L'heretabilitat (1) , també representada com a H2, és un estadístic descriptiu que podem definir com la proporció de variància fenotípica
d'una població que es deu a la seva variació genètica.
(1) Heretabilitat en sentit ampli o heretabilitat àmplia.
Aquesta variància genètica es pot descompondre en variància genètica additiva (A), en la qual valors genotípics provoquen efectes lineals en el fenotip; variància
genètica no additiva (D), que representa influències genètiques com la dominància (interaccions entre al·lels
en un mateix locus) i variància genètica epistàtica (I) o interaccions entre loci, també conegudes com a epístasi. En definitiva, l'heretabilitat àmplia potser es
podria representar així:
A més de l'heretabilitat en sentit ampli, també podem parlar de l'heretabilitat en
sentit estricte (h2, en minúscules). En aquest sentit, l'heretabilitat en sentit estricte és la proporció
de la variància del fenotip que és transmissible dels pares a la descendència, i que
es pot utilitzar per a predir els canvis a la mitjana poblacional amb les tècniques
de selecció. Aquesta variància és l'única que es deu només a factors genètics additius.
Per tant,
A diferència de l’heretabilitat en sentit ampli, que no té cap tipus d’aplicació pràctica,
sinó merament descriptiva, l’heretabilitat en sentit estricte sí que en té. Així,
aquesta última ens permet calcular la proporció de variància d’un tret que es transmet
d’una generació a una altra. Hem de destacar que només és aplicable a poblacions,
no a individus.
D'altra banda, les diferències ambientals entre individus també poden comportar diferències
fenotípiques entre ells. Així, la genètica del comportament ha ofert la millor evidència
per a mesurar la importància dels factors ambientals durant el desenvolupament.
Com en el cas de la variància genotípica, la variància ambiental també es pot descompondre
en dos tipus (vegeu l'equació 5): variància ambiental compartida (C), que contribueix a la similitud entre els membres d'una família, i variància ambiental
específica (E) o no compartida, que es defineix com les influències ambientals que fan que un individu
es diferenciï de la resta d'individus d'aquesta família; a més, també inclou l'error
de mesura:
Més concretament, què és el que entenem per variància ambiental compartida i variància ambiental no compartida? Bàsicament, es correspon a l'ambient compartit i al no compartit. Vegem en detall
a què es refereix cada concepte.
1) Ambient compartit
Són els factors ambientals que comparteixen els membres d'una mateixa família i que
els fan similars entre ells.
2) Ambient no compartit
Són els factors ambientals que els membres d'una família no comparteixen i que tendeixen
a diferenciar-los entre ells.
De vegades, es pot confondre l'ambient no compartit amb l'ambient no familiar, però
podem veure que l'ambient no compartit es pot produir dins de l'entorn familiar immediat.
Aquest tipus d'influències s'ha vist que és molt important en psicopatologia, respecte
a les habilitats cognitives i respecte a la personalitat. Al contrari, i curiosament,
aquest tipus d'ambient fa més semblants els bessons monozigòtics que han viscut separats:
com més grans d'edat, més semblants, ja que seleccionen els seus propis ambients segons
el seu genotip (ho veurem en l'apartat següent), i això els fa similars, ja que és
idèntic.
Definició, terminologia i exemples per a indicar les influències causades per l'ambient
compartit i no compartit.
Font: taula adaptada de Martí i Carbonell i Darbra i Marges, 2006
Font: taula adaptada de Martí i Carbonell i Darbra i Marges, 2006
|
Definició
|
Terminologia usada
|
Exemples
|
|
|---|---|---|---|
|
Ambient compartit
|
Tots els factors ambientals compartits entre els familiars i que fan que els parents
s'assemblin entre ells.
|
|
I)Dieta
II)Nivell sociocultural dels pares
|
|
Ambient no compartit
|
Tots els factors ambientals no compartits entre els familiars i que fan que els parents
siguin diferents entre ells.
|
|
I)Interaccions entre germans
II)Accidents o malalties
III)Relacions extrafamiliars
|
1.2.2.Com es relacionen ambient i genotip?
Genotip i ambient, i els seus corresponents estimadors, no són entitats estanques
i sense cap tipus de relació entre elles, més aviat al contrari, s'acostumen a interrelacionar,
i normalment de forma imbricada, la qual cosa dificulta la tasca d'investigar aquestes
relacions. En general, ambient i genotip es poden correlacionar, o bé interactuar;
ara veurem de què es tracta en cada cas.
A representa la variància genètica additiva; C representa la variància ambiental compartida,
i E, la variància ambiental específica.
1) Correlacions genotip-ambient
La correlació entre gens i ambient es refereix al fet que un individu amb un genotip
determinat tendeix a desenvolupar-se en aquells ambients que siguin propensos a afavorir
l'expressió d'aquest genotip.
Tradicionalment, s'ha proposat una taxonomia amb tres tipus de correlacions diferents:
-
Correlació passiva: es refereix al fet que l'ambient on es desenvolupa un individu afavoreix l'expressió del seu genotip. Es denomina passiva perquè ni el comportament ni el genotip de l'individu determinen l'ambient on es troba. Es produeix en casos en els quals, per exemple, els pares aporten ambients de criança que es correlacionen amb els gens que han transmès als fills.
-
Correlació activa: es refereix a la correlació que s'estableix quan és la propensió genètica de l'individu la que provoca que aquest busqui, i eventualment seleccioni, l'ambient o experiències que més afavoreixin l'expressió d'aquesta propensió genètica.
-
Correlació evocativa (o reactiva): es refereix a aquella per la qual s'estableix una relació "evocada" entre els factors genètics i els ambientals, en la qual és la mateixa expressió del genotip la que provoca situacions (reaccions) que afavoreixen l'aparició de factors ambientals propicis al seu desenvolupament.
En alguns casos, aquesta correlació es pot quantificar, i es formula com a rGA (encara
que en anglès es coneix com a rGE, per genotype-environment), o més concretament com a:
2) Interaccions genotip-ambient
En general, la interacció genotip-ambient fa referència a la forma com els gens i
l'ambient afecten el fenotip conjuntament, i es poden definir com el control genètic
de la sensibilitat a les diferències ambientals.
D'aquesta manera, un mateix gen es pot manifestar de formes diferents sota la influència
d'ambients diferents, o bé al·lels diferents d'un gen poden moderar la influència
d'un mateix ambient. Més endavant, en veurem alguns exemples concrets.
Malgrat ser conceptes similars, el concepte de correlació s'ha de diferenciar clarament
del d'interacció. El concepte d'interacció fa referència a com l'ambient pot regular
diferencialment l'expressió dels gens, mentre que el concepte de correlació indica
que l'ambient al qual està exposat un individu tendeix a estar associat en certa mesura
al seu genotip. És a dir, no hi ha una distribució aleatòria d'exposició a determinats
ambients, sinó que alguns genotips tendeixen a expressar-se en ambients determinats.
Aquest tipus d'interaccions és molt important en les psicopatologies i també en les
característiques de personalitat.
En les abscisses, hi ha dos tractaments diferents; en les ordenades, el resultat fenotípic
d'aquest tractament en persones amb sensibilitat diferent de cada fàrmac (sensibilitat
que és determinada pel seu genotip).
Com regula l'ambient l'expressió dels gens?
Aquesta regulació ambiental de l'activitat d'un gen es diu regulació epigenètica. Hi ha un exemple ben conegut respecte al comportament; es tracta de la conducta
maternal en rates, i està relacionada amb la manera com es transmet la forma de respondre
a l'estrès d'una generació de rates a una altra.
Hi ha dos tipus de conducta maternal en els primers dies després del part en rates:
una en la qual la mare empolaina i llepa els cadells, i l'altra en la qual, al contrari,
arqueja el llom. Les rates que mostren una freqüència elevada d'aquests comportaments
tenen un nombre més gran de receptors de glucocorticoides en l'hipocamp. Això els
confereix un cert avantatge, ja que poden respondre millor a l'estrès. Doncs bé, estudis
recents han constatat que aquests comportaments provocaven una metilació més gran
o més petita de la regió promotora del gen del receptor de glucocorticoides (GR) en
els cadells. En altres paraules, les cries que eren més llepades i empolainades, presentaven
una regió promotora GR demetilada, mentre que les cries de les mares que no eren tan
llepades i empolainades presentaven aquesta mateixa regió més metilada.
Aquest treball té un gran valor, ja que demostra que el comportament pot induir canvis
epigenètics en l'estat del genoma, i com després aquests canvis són estables al llarg
de la vida.
En resum, les relacions entre gens i ambient són molt complexes; d'una banda, tenim
que l'ambient pot modular l'expressió dels gens, que els gens poden modular l'impacte
de l'ambient durant el desenvolupament, i que, de l'altra, els gens poden arribar
a determinar l'ambient en el qual s'expressen. Així doncs, la relació entre els gens
i l'ambient és bidireccional.
1.2.3.Unint les peces del trencaclosques: la descomposició de la variància fenotípica o total
Finalment, per a completar el que s'ha explicat fins ara, hem d'unir totes les peces
aïllades que hem vist: els gens (o variància genotípica), l'ambient (o variància ambiental)
i la interacció entre ambdós. Habitualment, s'expressa segons l'equació següent:
A partir d'aquesta equació, es poden calcular paràmetres com l'heretabilitat o l'ambientalitat,
segons diferents models, com veurem més endavant quan parlem dels tipus de models
en els estudis de bessons.
Usualment, per a la majoria de trets psicològics, la seva distribució fenotípica acostuma
a ser normal. És a dir, la majoria de la població mostra fenotips semblants a la mitjana,
mentre que a mesura que ens allunyem de la mitjana disminueix la freqüència d'individus
amb altres fenotips. En els estudis en què descomponem la variància total, el que
fem és estudiar quina part de la desviació del conjunt dels fenotips s'explica pels
factors que hem comentat fins ara.
En el gràfic, podem veure quin percentatge d'individus presenta fenotips allunyats;
com a molt, una desviació típica, dues o tres.
1.3.Dissenys i mètodes de recerca
1.3.1.Estudis de bessons
Com és ben sabut, la manipulació genètica en humans té limitacions ètiques, i fins
i tot la recerca en genètica del comportament és qüestionada per alguns. Per això,
aquesta recerca té una sèrie de limitacions pràctiques inherents que no tenen altres
branques del coneixement científic. Tanmateix, la naturalesa ens ha brindat el que
alguns consideren un fantàstic experiment natural; es tracta dels bessons dizigòtics (DZ) i monozigòtics (MZ).
Les parelles de bessons DZ i MZ (quan són del mateix sexe) es diferencien bàsicament
perquè els primers comparteixen el 50% dels seus gens de mitjana, mentre que els segons
en comparteixen el 100%, i ambdós comparteixen el 100% de l'ambient compartit, i també
res de l'ambient específic o no compartit.
Es pot destacar que, gràcies a aquest tipus d'estudis, podem separar la variable ambient
en els components compartits i independents (per exemple, les diferències entre parelles
de bessons monozigòtics que han viscut junts es deuen a l'ambient no compartit). També
possibiliten els estudis de control, per exemple, fer una intervenció en el bessó
A i en l'altre no, per a provar l'eficàcia d'un tractament. Permeten examinar les
condicions de manifestació d'una psicopatologia (analitzant els factors ambientals
de risc). Però no tot són avantatges; per exemple, l'ambient prenatal i postnatal
dels bessons MZ pot ser que sigui més semblant que el dels DZ (això ho veurem més
endavant).
Vegem com es pot estudiar la influència genètica i ambiental en un tret mitjançant
estudis de bessons.
1) El model ACE
Aquest model, conegut per les inicials dels seus components en anglès (additive genetic variance, common environment variance i error+specific environment), ha estat utilitzat àmpliament en la genètica del comportament des de la dècada
de 1970, i encara és vigent amb algunes modificacions. Mitjançant l'ús de models d'equacions
estructurals, permet descompondre la variància de manera eficaç i relativament senzilla
(Gallardo-Pujol et al., 2007).
Aquest model assumeix que tota la variància genètica és additiva i que no hi ha interacció
entre factors genètics i ambientals; per això, de l'equació que vèiem més amunt, en
podem derivar la que segueix:
Malgrat aquesta simplificació, permet determinar la contribució relativa de l'ambient
i dels gens en un tret determinat. Encara que hi ha altres fórmules més senzilles (2) per a calcular l'heretabilitat en sentit estricte d'un tret comparant bessons MZ
i DZ, aquestes tendeixen a estimar-la de manera incorrecta; a més, l'ús de models
d'equacions estructurals presenta avantatges afegits. És possible contrastar hipòtesis
de forma estadística i comparar si realment cadascuna de les fonts de variància (A,
C o E) són significatives per a aquest model o no. És a dir, permet determinar si
A, C o E realment determinen part de la variància fenotípica del tret en qüestió o
no. En la figura següent podem veure la seva forma més senzilla.
(2) La forma més senzilla d'obtenir una estimació de l'heretabilitat d'un tret és utilitzant
la fórmula de Falconer:
Breument, consisteix a calcular la correlació per a un tret entre bessons dizigòtics, fer el mateix entre bessons monozigòtics, calcular la diferència entre ambdues i multiplicar-la per dos. Aquesta fórmula assumeix que no hi ha interacció entre factors genètics i ambientals, per la qual cosa tendeix a subestimar l'abast de les influències genètiques. Falconer la va redefinir com a:
Breument, consisteix a calcular la correlació per a un tret entre bessons dizigòtics, fer el mateix entre bessons monozigòtics, calcular la diferència entre ambdues i multiplicar-la per dos. Aquesta fórmula assumeix que no hi ha interacció entre factors genètics i ambientals, per la qual cosa tendeix a subestimar l'abast de les influències genètiques. Falconer la va redefinir com a:
Les variables latents (rodones) representen la variància genètica additiva (A), l'ambient
compartit (C) i l'ambient específic (E) per a cada parella de bessons. Els quadrats
representen la variable que estem mesurant en cada membre de la parella de bessons
(R1 i R2). Les fletxes amb dues puntes representen correlacions i les fletxes amb
una sola punta representen rutes causals.
D'altra banda, algunes vegades, en psicologia, les variables no són observables, sinó
que són variables latents, com els trets de personalitat o g, una mesura d'intel·ligència. Arribat aquest moment, les coses es compliquen i cal
afegir aquestes variables al model, i llavors es coneix com a model psicomètric.
Tanmateix, aquests models, així com els estudis de bessons, tenen una sèrie de limitacions.
Entre elles, les més destacables són: la simplificació excessiva de les relacions
entre genotip i ambient, d'una banda, i també les crítiques al biaix de les mostres
de bessons o el fet de no tenir en compte els ambients prenatals. Per contra, la versatilitat
d'aquests models per a tenir en compte l'aparellament selectiu, la transmissió "cultural"
d'algunes característiques o la utilització de grans mostres (per exemple, el Twin
Early Development Study, una mostra de més de 15.000 parelles de bessons al Regne
Unit [Trouton, Spinath i Plomin, 2002]) representatives de la població general fan
que aquestes limitacions es comencin a superar. Així, encara que alguns critiquen
la poca utilitat que poden tenir avui en dia aquests models, es mostren útils quan
es tracta d'estudiar la contribució relativa del genotip o l'ambient en qüestions
com les dificultats de lectoescriptura o l'assetjament escolar o bullying.
Com acabem de mencionar, els estudis de bessons no estan exempts de problemes. Alguns
dels més rellevants són l'assumpció dels ambients iguals, i l'altre és el fenomen
de l'aparellament selectiu.
L'assumpció dels ambients iguals assumeix que tant els bessons monozigòtics com els dizigòtics comparteixen ambients
comparables respecte a la característica d'interès. Això és, els bessons monozigòtics
no són més similars entre ells per a un determinat tret simplement perquè siguin tractats
de manera més similar. Si bé és cert que hi ha algunes diferències bàsiques entre
l'ambient a què estan exposats els bessons monozigòtics i els dizigòtics, la major
part de les investigacions que s'han ocupat del tema ha confirmat aquesta assumpció
(DiLalla, 2004).
El segon problema rellevant és el de l'aparellament selectiu. És ben sabut que hi ha una tendència a buscar parella amb unes característiques
de personalitat i intel·ligència semblants a les nostres (Colom, Aluja-Fabregat i
García-López, 2002); si això succeeix en el cas dels pares de bessons dizigòtics,
compartirien més gens relacionats amb la personalitat o la intel·ligència que els
esperables per atzar. Això reduiria la diferència amb els bessons monozigòtics, i
facilitaria una estimació d'heretabilitat més baixa del que en realitat és. Tanmateix,
mitjançant la utilització de models d'equacions estructurals, aquesta circumstància
es pot modelitzar fàcilment.
1.3.2.Estudis de famílies
En aquest tipus d'estudis, es compara un tret entre subjectes relacionats biològicament.
Si el tret és qualitatiu, serà més freqüent com més estreta sigui la relació entre
els parents (grau de parentiu). Si el tret és quantitatiu, la semblança (mesurada
amb un coeficient de correlació) serà més gran com més estreta sigui la relació biològica.
És preferible que els familiars hagin estat criats de manera separada, ja que si no
hi ha l'inconvenient que comparteixin herència i ambient.
Els estudis familiars són útils per a:
-
Entendre l'heterogeneïtat d'un diagnòstic: en una família hi pot haver afectats d'esquizofrènia, però també, com veurem més endavant quan parlem de psicopatologies, afectats de depressió unipolar o trastorn bipolar, la qual cosa vol dir que és possible que hi hagi una relació genètica entre aquestes malalties.
-
Fer estudis d'alt risc: estudis longitudinals dels descendents joves dels afectats. Aquest tipus d'estudis permeten obtenir informació dels factors de risc i protecció, i conèixer els símptomes primerencs a partir dels fills dels afectats. Permeten identificar individus vulnerables i fer-ne una prevenció.
-
Comprendre l'expressivitat variable del gen o gens, ja que com que són de la mateixa família, el gen és el mateix.
-
Conèixer el tipus d'herència, mitjançant pedigrís.
Tanmateix, també tenen desavantatges, ja que els familiars:
-
Comparteixen tant herència com ambient,
-
tenen edats diferents, i
-
pertanyen a generacions diferents (pares i fills).
1) Estudis d'adopcions
En els estudis d'adopcions, les variables genètiques i ambientals poden ser separades
pel procés d'adopció, sempre que l'ambient de destinació no sigui similar a l'ambient
d'origen. El principal avantatge és que permeten l'anàlisi de la interacció entre
gens i ambient, en comparar fills que viuen amb els seus pares biològics i d'altres
que no. Hi ha diversos dissenys possibles en el cas dels estudis d'adopcions:
a) Mètode de l'estudi dels adoptats: es comparen els fills de pares biològics afectats i adoptius no afectats amb controls
(fills de pares biològics i adoptius no afectats).
b) Mètode de les famílies dels adoptats: es comparen els familiars (tant biològics com adoptius) dels adoptats amb els familiars
dels adoptats no afectats.
c) Mètode de la criança encreuada o cross-fostering: es comparen tres grups entre ells. El primer consta de fills amb pares biològics
afectats i pares adoptius no afectats. El segon consta de fills amb pares biològics
no afectats i pares adoptius afectats. El tercer grup és un grup control (fills de
pares biològics i adoptius no afectats).
Tanmateix, aquests estudis són menys freqüents que els de bessons, ja que és més dificultós
trobar una mostra d'adoptats que compleixi les condicions necessàries de potència
estadística que una mostra de bessons (DiLalla, 2004).
1.3.3.Anàlisi d'extrems
En alguns casos, ens podem trobar que la característica que pretenem estudiar no és
qualitativament diferent d'una característica distribuïda de manera normal en una
població, sinó qualitativament. Per exemple, podríem fer la hipòtesi que la dislèxia
sigui un extrem de la distribució de les habilitats lectores en la població general.
En aquest cas, l'anàlisi d'extrems (o anàlisi DF, en honor als seus creadors, DeFries-Fulker) utilitza els valors dels
casos dels extrems i els dels seus familiars. Breument, les puntuacions mitjanes de
lectura dels germans no afectats de cada parella de bessons MZ estaran més allunyades
de la mitjana de la població que les puntuacions mitjanes dels germans no afectats
de dislèxia de cada parella de bessons DZ. L'anàlisi de les dades s'efectua mitjançant
models de regressió, que poden ser multivariants, incorporar covariables i són relativament
flexibles. Va ser una tècnica bastant utilitzada en no ser computacionalment tan exigent
com els models d'equacions estructurals que hem explicat una mica més amunt. Ara,
tanmateix, s'han vist superats per aquests últims.
Aquesta aproximació, no obstant això, va establir les bases per al que es coneix com
a anàlisi de les diferències entre germans (sib pairs analysis) com a forma per a incrementar la potència estadística en detectar efectes dels gens
en mostres no excessivament grans. Més endavant, veurem com funciona.
1.3.4.Cartografia de QTL i estudis de lligament
A diferència dels dissenys comentats fins ara, que formen part de la genètica quantitativa,
els estudis d'associació i lligament formen part de les tècniques d'estudi de la genètica
molecular, ja que es comparen fragments concrets d'ADN. Ambdós tipus d'estudis són
complementaris i generalment ambdós són necessaris abans de poder relacionar, definitivament,
un marcador genètic amb un tret conductual o una malaltia.
En molts casos, encara que trobem que un gen està associat a un tret determinat, pot
passar que després no aconseguim replicar l'efecte trobat, o que aquest efecte sigui
molt petit. Això és a causa que característiques tan complexes com el comportament
són influïdes per múltiples gens d'efectes molt petits. Aquests gens, cadascun amb
un efecte relatiu petit, es denominen QTL (de l'anglès quantitative trait loci, o llocs de tret quantitatiu).
En la cartografia de QTL, es poden analitzar parts del genoma o el genoma sencer.
És una tècnica basada en les tècniques de lligament que consisteix a explorar, mitjançant
la utilització de marcadors situats de manera més o menys equidistant (aproximadament
10 cm), l'associació d'aquests marcadors amb el fenotip. L'objectiu és trobar un marcador
que significativament sigui més probable que estigui associat a un tret que per atzar.
Normalment, quan es detecta un QTL associat a un tret, no es detecta el gen pròpiament
dit, però sí que és possible que en aquesta regió es trobi el gen que provoca l'efecte
que hi observem.
Però, com mesurem si una posició està associada a un altre marcador? Doncs amb el
que es diu lod score. El lod score és el logaritme en base deu de l'odds ratio o versemblança depenent de la freqüència de recombinació de dos loci propers. Com més elevada és aquesta quantitat, més gran és la probabilitat que hi
hagi lligament i que aquesta regió estigui associada al fenotip que observem. Vegem-ne
un exemple a continuació.
En aquesta figura, podem veure els 22 autosomes i alguns loci amb unes puntuacions LOD més elevades. Concretament, es tracta de dues regions, una de situada al cromosoma
3, i l'altra situada al cromosoma 10, que són susceptibles de presentar lligament.
Aquest estudi correspon a un estudi que explora el consum de cànnabis durant l'adolescència
(Hopfer et al., 2007). Respecte als criteris per a interpretar una puntuació LOD, en podeu trobar més informació a Lander i Kruglyak (1995).
1.3.5.Estudis d'associació
Els estudis d'associació comparen diferents poblacions i estudien si una determinada
mutació o variant del marcador (per exemple, un al·lel d'un gen) és incrementada o
disminuïda significativament en la població subjecta a estudi. Aquesta comparació
permet el càlcul d'uns valors estadístics anomenats raó d'avantatges (odds ratio en anglès), que ens indiquen quin és el risc de presentar un tret qualitatiu o una
malaltia en els portadors en comparació dels no portadors d'aquesta variant.
1.4.Errors que s'han d'evitar en la interpretació d'estudis en genètica del comportament
Entorn de la genètica del comportament i l'estudi de l'herència dels trets psicològics,
s'ha creat una sèrie d'equívocs i de concepcions errònies que convé destacar (Andrés-Pueyo, 1997):
1) Error 1: els efectes genètics sobre els trets psicològics són del tipus tot o res.
De fet, els efectes genètics en el comportament es coneixen en termes quantitatius
i els estudis empírics, com hem vist, es fonamenten a conèixer quin és el valor de
l'efecte dels gens sobre la conducta.
2) Error 2: la via d'acció d'un gen sobre una conducta o tret és simple, específica i directa.
Res més lluny de la realitat, com veurem més endavant, sobre les relacions entre fenòmens,
el genètic i el psicològic, que actuen en plans d'explicació molt diferents i allunyats.
3) Error 3: si un tret té un component genètic és immutable.
Aquesta idea errònia sembla no tenir en compte el component de canvi de l'individu
humà i la forma diferencial d'actuar dels gens en funció del moment del desenvolupament
individual.
4) Error 4: les conductes o trets que són influïts per mecanismes genètics apareixen precoçment
en el desenvolupament de l'individu.
Habitualment, es considera que tot el repertori d'aspectes del comportament que té
una certa influència genètica ha d'aparèixer en el moment del naixement i que, al
llarg del desenvolupament, només els efectes de l'ambient quedaran patents. El coneixement
dels mecanismes d'acció genètica ha demostrat la falsedat d'aquest tipus d'arguments,
ja que els gens actuen no únicament en el moment de la concepció, sinó que ho fan
durant tota la vida de l'individu.
Aquestes idees, molt difoses, són errònies i actualment hi ha indicis aclaparadors
per a rebatre'n qualsevol. Al llarg dels mòduls següents, oferirem alguns estudis
que exemplificaran alguna d'aquestes concepcions errònies.
2.Mètodes i tècniques de laboratori
L'aplicació de la tecnologia de l'ADN i dels mètodes d'amplificació d'àcids nucleics
ha suposat una revolució metodològica autèntica en el camp de la genètica humana.
La seqüenciació completa del genoma humà, en el context del Projecte Genoma Humà, és el començament del que ha estat denominat era geonòmica, i el coneixement que ha derivat està permetent donar resposta a una sèrie de preguntes
bàsiques sobre com s'organitza la informació genètica a les cèl·lules, quins han estat
els processos evolutius de la nostra espècie i, particularment, s'està aprofundint
en les bases genètiques de moltes malalties, incloent-hi aplicacions en el diagnòstic,
pronòstic i fins i tot el seu tractament efectiu, mitjançant disciplines que s'estan
desenvolupant actualment com la farmacogenòmica, farmacogenètica i teràpia gènica.
En aquest apartat repassarem una sèrie de tècniques que seran d'utilitat si volem
fer una aproximació al coneixement de les diferents malalties, de trets de conducta
o d'organismes biològics, des d'un punt de vista genètic.
Respecte a les malalties, se sap que algunes són causades per un sol canvi genètic
que es transmet de manera dominant de generació en generació, mentre que d'altres
tenen un patró d'herència recessiu, amb penetrància incompleta, o bé hi ha una interacció
complexa entre molts factors ambientals i altres de genètics. En alguns casos, coneixem
quins són exactament els gens causants d'una malaltia determinada, mentre que d'altres
patologies encara en coneixem molt poc.
És possible que vosaltres us plantegeu en el futur fer diagnòstic genètic o bé recerca
per a augmentar el coneixement d'alguna patologia o característica psiquiàtrica o
psicològica. En aquest apartat, es farà una descripció de quines són aquestes tècniques
que podríeu utilitzar. Però abans, explicarem alguns conceptes bàsics que després
ens seran d'utilitat per a comprendre aquestes tècniques.
2.1.Conceptes generals
Hi ha múltiples sistemes per a fer l'extracció i purificació d'ADN genòmic a partir
de diferents teixits humans. Aquí ens centrarem en la metodologia d'anàlisi una vegada
s'ha obtingut aquest ADN a partir d'algun d'aquests mètodes.
2.1.1.Reacció en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction: PCR)
L'amplificació enzimàtica de l'ADN consisteix en l'obtenció de còpies d'una seqüència
específica d'ADN mitjançant una reacció en cadena de l'ADN polimerasa (PCR).
L'aplicació d'aquesta metodologia als laboratoris de genètica és imprescindible avui
en dia.
Les ADN polimerases són enzims que duen a terme la replicació de l'ADN. S'obtenen
a partir de microorganismes termòfils adaptats a viure en afloraments termals, com
Termophilus aquaticus. Per a això, necessiten una molècula d'ADN de cadena senzilla que actuï com a motlle,
un encebador (una molècula d'ADN d'uns 15 a 20 nucleòtids que hibrida amb l'ADN genòmic,
en tenir-ne una seqüència complementària) i els quatre tipus de nucleòtids activats
o trideoxinucleòtids, per a ser incorporats a la cadena naixent de forma específica.
Aquests trideoxinucleòtids o dNTP seran els "maons" a partir dels quals s'aniran sintetitzant
les noves cadenes d'ADN. Recordem que químicament són pentoses unides a un grup energètic
de tres fosfats en el carboni 5', a quatre possibles purines o pirimidines diferents
en el carboni 1' i a un grup hidroxil en el carboni 3'. Aquestes seran les adenines
(A), guanosines (G), citosines (C) i timines (T).
Recordem, també, que les dues cadenes d'ADN (o els dos encebadors amb l'ADN) s'acoblen
normalment de manera antiparal·lela mitjançant enllaços de ponts d'hidrogen entre
bases complementàries (A amb T i G amb C).
Mitjançant l'aplicació de calor i concentracions salines adequades, les dues cadenes
es poden separar. Es diu llavors que l'ADN està desnaturalitzat. Si es restableixen
les condicions inicials, les cadenes d'ADN es tornaran a unir específicament per les
zones complementàries, és a dir, hibridant-se.
Ara, resumirem en què consisteix la reacció de PCR: la barreja d'NTP, ADN, oligonucleòtids
i polimerasa és sotmesa a cicles repetits de diferents temperatures per a afavorir
la separació de les dues cadenes del fragment d'ADN d'interès, la hibridació dels
oligonucleòtids i la seva posterior síntesi de cadenes noves. A la temperatura de
94 °C se separen les cadenes d'ADN; després, per a afavorir l'aparellament de l'oligonucleòtid
amb la seva seqüència complementària d'ADN, es redueix la temperatura fins a un valor
específic per a cada parell d'oligonucleòtids (50-65 °C). L'ADN polimerasa iniciarà
llavors l'extensió de la cadena, normalment a 72 °C. I a partir d'aquí es va repetint
aquest cicle unes 30 o 40 vegades.
Teòricament, la cinètica que segueix la reacció és N x 2
n
, on N és el nombre de molècules inicials del fragment diana i n el nombre de cicles de PCR fets, de manera que segueix un creixement exponencial
i després de 30 o 40 cicles hi haurà milions de còpies més que les existents originalment
(Mullis et al., 1992).
2.1.2.Separació electroforètica d'àcids nucleics
Una vegada s'ha fet l'extracció d'ADN a partir de teixit, o una amplificació de diversos
fragments seus, aquest es pot fraccionar de manera senzilla mitjançant una electroforesi.
La utilitat de fer això ja la veurem més endavant. En aquest mètode, es disposa l'ADN
en una matriu semisòlida composta per un polímer prèviament estabilitzat (agarosa
o acrilamida), el qual actua com una xarxa que dificulta el pas de les molècules en
funció de la seva mida. Per a induir el desplaçament per la matriu s'hi aplica un
camp elèctric i les molècules es desplacen cap al pol positiu. L'electroforesi es
fa en un tampó a pH bàsic (usualment 1xTBE) de manera que les molècules d'ADN estan
carregades negativament. Com que la relació de càrrega neta de cada molècula amb aquest
pH és la mateixa sigui quina sigui la seva mida, el paràmetre discriminatori per a
la seva separació és la mida del fragment. És a dir, les molècules més petites passaran
més fàcilment a través de la malla, mentre que les grans hi quedaran retingudes o
aniran més lentament.
Depenent de la mida de cadascuna de les molècules que cal separar, es poden utilitzar
diferents concentracions d'agarosa o acrilamida, la qual cosa condicionarà la mida
dels porus a la malla i, per tant, la velocitat dels fragments que els travessen.
A més, la concentració del polímer condicionarà el rang de mides d'ADN dins de les
quals pot discriminar (per exemple, una malla molt laxa o amb els porus molt grans
no podrà discriminar entre fragments d'ADN gaire petits, ja que aquests passaran sense
cap "esforç" entre aquests porus). Els polímers d'acrilamida creen una malla més uniforme
que les d'agarosa i són capaços de discriminar diferències de mida més precises (Sambrook
et al., 2001).
La taula següent ofereix una idea sobre el rang de concentracions de cada polímer,
segons la mida de fragments que cal separar.
Rang efectiu de separació de molècules d'ADN en parells de bases (pb) en gels de A) acrilamida bis acrilamida 29:1 i B) agarosa (taula de Sigma-Aldrich). Juntament amb la mostra es carreguen dos colorants
a partir dels quals es pot anar observant en temps real com es produeix la mobilitat
dins del gel (blau de bromofenol i xilencianol). La mobilitat d'aquests colorants
en el gel s'especifica com a equivalència en parells de bases.
|
A) acrilamida
|
|||
|
Concentració acrilamida (%)
|
ADN (pb)
|
Xilencianol (pb)
|
Blau de bromofenol (pb)
|
|
3,5
|
1.000-2.000
|
460
|
100
|
|
5,0
|
50-500
|
260
|
65
|
|
8,0
|
60-400
|
160
|
45
|
|
12,0
|
40-200
|
70
|
20
|
|
15,0
|
25-150
|
60
|
15
|
|
20,0
|
6-100
|
45
|
12
|
|
B) agarosa
|
|||
|
Concentració d'agarosa %
|
ADN (pb)
|
||
|
0,3
|
5.000-6 x 104
|
||
|
0,6
|
1.000-2 x 104
|
||
|
0,7
|
800-1.000
|
||
|
0,9
|
500-700
|
||
|
1,2
|
400-600
|
||
|
1,5
|
200-300
|
||
|
2,0
|
100-200
|
||
Després, per a visualitzar les bandes en el gel (corresponents als diferents fragments
d'ADN), és necessari tenyir el gel en una solució de bromur d'etidi, el qual s'uneix
a l'ADN amb gran afinitat, i s'observa posteriorment mitjançant una làmpada de llum
ultraviolada. La llum ultraviolada produeix fluorescència en l'ADN unit al bromur
d'etidi. També poden ser utilitzats altres mètodes per a tenyir l'ADN i observar-lo
dins del gel, com la tinció amb plata (Sambrook et al., 2001).
2.1.3.Mutacions o polimorfismes
Canvis en la seqüència de l'ADN es denominen mutacions o polimorfismes. Per conveniència, quan una mutació és present en menys de l'1% de la població i
no genera cap fenotip patològic se sol denominar polimorfisme. Anomenarem fenotip l'expressió del genotip en un ambient determinat. Els trets fenotípics inclouen trets
tant físics com conductuals.
Podem distingir diversos tipus de canvis o mutacions de l'ADN:
1) Canvis senzills de nucleòtids. Una base –o nucleòtid– és substituïda per una altra de diferent. En aquest cas,
hi haurà dos al·lels dins del mateix locus, un de canviat i l'altre normal (en genètica de poblacions, anomenat al·lel salvatge o wild). Per conveniència, utilitzarem les sigles en anglès SNP (single nucleotide polymorphism) per a aquest tipus de polimorfismes.
2) Petites delecions o insercions. Un nombre reduït de nucleòtids es perden o insereixen, de manera que alteren la
seqüència i mida de la molècula d'ADN. Pot incloure des d'una deleció/inserció d'una
sola base en un o diversos exons dins d'un gen. Altres mutacions en el genoma poden
ser causades per una inserció d'una seqüència més gran d'ADN addicional. En ambdós
casos, hi ha la possibilitat que es trenqui el marc de lectura, això és, que a partir
d'on es produeixi la inserció/deleció es canviï la interpretació en el procés de traducció
proteica i es canviï completament la seqüència de la proteïna original, de manera
que no tingui funció metabòlica.
3) Canvis en el nombre de repeticions d'una seqüència d'ADN. Entre elles hi ha les mutacions microsatèl·lits, que són repeticions en tàndem de
seqüències d'entre 2 i 4 parells de bases (pb), i minisatèl·lits, que són repeticions
de pb d'entre 6 i 100 pb. Algunes mutacions microsatèl·lits són inestables o dinàmiques
a causa que el nombre de repeticions d'aquestes variants pot canviar d'una generació
a l'altra. Aquest nombre de repeticions pot estar directament associat amb la patogenicitat.
4) Grans reorganitzacions. Guanys, pèrdues o canvis en l'orientació de grans fragments d'ADN. Aquestes reorganitzacions
poden incloure un gen sencer o un grup de gens i, de vegades, és possible visualitzar-les
en el cromosoma en metafase mitjançant el microscopi.
El possible efecte funcional o no d'aquest tipus de canvis en la proteïna resultant
pot ser determinat per diversos factors: que es produeixi un canvi en la seqüència
de la proteïna o bé una proteïna truncada, o bé que s'alteri l'estabilitat de l'ARN
missatger (ARNm) o canvis en l'expressió gènica, que donarien lloc a canvis en els
nivells de proteïna, etc. Dit d'una altra manera, la forma com una mutació causa una
malaltia determinada, o alguna característica fenotípica, pot ser determinada per
diferents mecanismes.
A més, fins i tot en cas que la mutació genètica produeixi un canvi en la seqüència
de la proteïna resultant, per exemple mitjançant un canvi d'aminoàcid per un altre,
no provoca necessàriament un canvi en la funcionalitat de la proteïna, ja que això
dependrà de les característiques fisicoquímiques de l'aminoàcid canviat i de la regió
o domini de la proteïna en què s'hagi produït la mutació. Dit d'una altra manera:
un canvi genètic no cal que causi alteracions en el fenotip. Per exemple, quan trobem
una mutació en un gen candidat per a alguna malaltia ens hem d'assegurar que sigui
efectivament patogènica. Per a això, tenim diverses possibilitats.
1) Si es tracta d'un cas familiar, fer un estudi de cosegregació, és a dir, determinar
si dins d'una família, la mutació és present en els malalts i no hi és en els membres
sans.
2) Genotipar centenars d'individus en la població general per a determinar la possible
presència d'aquesta mutació. Si no hi és present serà més probable que es tracti d'una
mutació patogènica i no d'un polimorfisme innocu.
3) Prediccions informàtiques que computen la probabilitat que un determinat SNP, dins
d'una seqüència determinada, pugui causar alteracions en alguna activitat biològica,
o en l'empalmament alternatiu, l'expressió, etc.
4) Estudis funcionals (models animals, cel·lulars, etc.) amb els quals puguem comprovar
si la mutació causa una alteració funcional de la proteïna mutada.
2.1.4.Concepte d'haplotip, desequilibri de lligament i tagSNP. Projecte HapMap
És important comprendre bé aquest concepte, ja que tots els polimorfismes i mutacions
estan formant haplotips, i la seva utilització és molt útil en la recerca de gens
que influeixen en un fenotip determinat (Lee et al., 2005).
Recordem que per a cada parell de cromosomes rebem una cromàtide diferent de cada
progenitor, amb la qual cosa rebem, també, una dotació de mutacions i polimorfismes
de l'un i de l'altre. És a dir, hi ha una sèrie de mutacions en la mateixa cadena
d'ADN que es transmeten totes juntes: això és un haplotip. Teòricament, doncs, un
haplotip seria constituït per cadascun dels cromosomes. No obstant això, en cada generació
es produeix recombinació entre diferents cromàtides, i es barregen les cadenes d'ADN
i, per tant, també els diferents polimorfismes de cada progenitor. Aquesta recombinació
no és totalment a l'atzar, ja que hi ha zones de hot spots, o llocs amb més probabilitat de recombinació, amb la qual cosa els polimorfismes
entre dues àrees hot spots, o de recombinació contigües, tendiran a continuar transmetent-se en bloc i conservant-se
al llarg de moltes generacions. Aquí s'inclouria tota una sèrie de polimorfismes que
estarien formant un bloc de molts haplotips. Així, quan dos polimorfismes són dins
del mateix haplotip no segreguen independentment en cada generació, sinó sempre junts,
es diu llavors que ambdós polimorfismes es troben en desequilibri de lligament complet.
Com hem dit, cal tenir en compte que la recombinació meiòtica pot actuar en contra
de la conservació dels haplotips antics, per això el desequilibri de lligament complet
entre dos polimorfismes pot anar desapareixent amb el temps, passant per estadis de
desequilibri de lligament parcial. Vegem-ho amb un exemple.
Exemple
Imaginem dos SNP, ambdós dins del mateix parell de cromosomes, l'SNP1 amb dos al·lels
A i T, i l'SNP2 amb els al·lels G i C. Per a un individu determinat, hi ha tres genotips
possibles per a cada SNP (en negreta) i nou combinacions teòriques d'haplotips. En
la taula següent ho veurem millor. En cas que l'SNP1 tingui el genotip AA i l'SNP2
el genotip GC, no hi haurà indeterminació sobre els haplotips existents: hi seran
presents l'haplotip A-G i l'haplotip A-C. Observem que en el cas dels heterozigots
dobles hi ha dues possibles combinacions indeterminades d'haplotips que podrien existir
(amb el signe d'interrogació), o dit d'una altra manera, la fase és ambigua.
Es poden resoldre els haplotips ambigus, però requereixen sistemes treballosos de
clonatge i posterior seqüenciació. Tanmateix, quan es coneixen els genotips d'un nombre
elevat d'individus, és possible inferir estadísticament els haplotips en els casos
ambigus. Això es fa utilitzant mètodes de combinatòria, o funcions de màxima versemblança
combinats amb algoritmes EM (expectation-maximization) i podent ajustar amb covariables (Chen et al., 2008).
Això pot ser útil per a fer estudis d'associació cas-control, per a comparar estadísticament
si hi ha diferències significatives entre els haplotips d'un grup control i altres
casos patològics, o bé en relacionar un haplotip determinat amb algun tret quantitatiu
de la conducta.
Tot això ens porta al concepte de tagSNP. Com que hi ha molts polimorfismes que es transmeten en un bloc determinat seria
redundant genotipar-los tots; al contrari, si sabem que hi ha un desequilibri de lligament
complet podem genotipar-ne només un, el qual ens estarà donant informació sobre tota
la sèrie de polimorfismes associats a aquest tagSNP.
Com a derivació del Projecte Genoma Humà, s'ha elaborat una base de dades en la qual
es descriuen les diferents estructures haplotípiques en diverses poblacions humanes
analitzant centenars de milers d'SNP distribuïts al llarg de tot el genoma. S'ha utilitzat
ADN de 270 individus de quatre poblacions diferents (amb avantpassats europeus, africans
o asiàtics). Això ha permès determinar, a grans trets, les freqüències genotípiques
de cada polimorfisme conegut en cadascuna de les poblacions i la seva estructura haplotípica
particular. L'International HapMap Project ha creat així una base de dades accessible perquè la utilitzi la comunitat científica.
Amb aquest mitjà és possible seleccionar el mínim nombre de tagSNP en una població
que aportin la informació màxima d'una regió genètica concreta.
2.2.Hibridació d'àcids nucleics
Als laboratoris de biologia molecular s'usen normalment dos tipus d'anàlisis tradicionals
basades en hibridacions d'àcids nucleics (Southern i Northern blot). Ambdós mètodes es basen en la desnaturalització dels àcids nucleics i unió posterior
amb una sonda específica (una altra cadena d'ADN) de la seqüència d'interès (Sambrook
et al., 2001).
2.2.1.Southern blot
És una tècnica emprada per a detectar seqüències específiques d'ADN. L'ADN genòmic
es digereix mitjançant enzims de restricció (de seqüència de tall poc freqüent) en
fragments més petits, i aquests són separats mitjançant una electroforesi en un gel.
L'ADN és desnaturalitzat, transferit i fixat a un filtre de nitrocel·lulosa o niló.
Tradicionalment, aquest procés es duia a terme col·locant el gel d'agarosa sobre paper
filtre remullat en una solució anomenada de transferència (solució salina concentrada). A continuació, se situa la membrana sobre el gel i
a sobre una pila de paper filtre seca, i per capil·laritat la solució de transferència
és arrossegada a la pila de paper filtre, i l'ADN queda retingut a la membrana situada
al mig.
El que és veritablement important és que en aquest filtre quedaran representats els
fragments d'ADN com una rèplica de la que tenien al gel inicial. Llavors, una sonda
d'ADN marcada amb radioactivitat o amb un fluorocrom hibrida de forma específica amb
la seqüència d'interès. Després, es visualitzen els resultats mitjançant l'exposició
a una pel·lícula sensible a la radioactivitat o a la llum, depenent de si s'ha utilitzat
una sonda marcada amb radioactivitat o amb un fluorocrom. Aquest sistema és útil per
a la detecció de grans reorganitzacions cromosòmiques com translocacions, inversions,
etc.
2.2.2.Northern blot
Aquesta tècnica és molt similar a l'anterior, excepte que en aquest cas serveix per
a identificar seqüències d'ARN. L'ARN es fracciona en diferents mides mitjançant una
electroforesi en un gel, en unes condicions en les quals es mantinguin les cadenes
d'ARN en estat desnaturalitzat. El procés continua de manera semblant a la hibridació
de tipus Southern. El mètode del Northern s'utilitza per a fer estudis d'expressió
gènica en diferents teixits, de manera que es pugui identificar el patró d'empalmament
alternatiu dins d'un gen.
2.3.Mètodes de genotipatge de l'ADN
2.3.1.Seqüenciació d'ADN
La seqüenciació de l'ADN és la determinació de l'ordre dels diferents nucleòtids en
un fragment determinat.
Exemple
Supodem que als Estats Units es trobin unes mutacions determinades en un gen, les
quals provoquen autisme. Podem analitzar aquestes mutacions concretes en la nostra
població (per al diagnòstic, per exemple), però podria ocórrer que en la nostra població
hi hagués unes mutacions diferents del mateix gen que també fossin patogèniques. Per
a estar segurs d'analitzar de manera sistemàtica aquest gen, el millor és oblidar-se
de buscar-ne unes mutacions concretes i analitzar el gen sencer per a detectar-ne
totes les possibles mutacions.
El mètode més informatiu i fiable per a conèixer un gen o seqüència determinats és
fer-ne la seqüenciació directa. Tradicionalment, s'ha utilitzat el mètode d'acabament
de la cadena (o mètode de Sanger). En aquest mètode, es produeix l'extensió del fragment d'ADN en el seu estat de
cadena senzilla a partir d'un oligonucleòtid complementari d'una zona del gen. Aquesta
extensió de la cadena es produeix gràcies a l'acció d'un enzim (ADN polimerasa) en
presència dels quatre trideoxinucleòtids (dNTP). Recordem-ho, com en el cas de la
PCR, llevat que en aquest cas no serà un procés cíclic. A més, barrejats entre ells
en una proporció baixa hi haurà dideoxinucleòtids (ddNTP), normalment marcats radioactivament,
els quals en afegir-se a la cadena naixent acabaran la síntesi de les molècules en
les quals s'insereixin, ja que bloquegen la incorporació de nucleòtids nous. Al contrari,
quan en una cadena d'ADN s'insereix únicament dNTP es continuarà allargant sense problemes.
Amb aquest procés, obtindrem tota una sèrie de fragments d'ADN de diferents mides,
ja que els ddNTP s'hauran incorporat en llocs diferents. Això s'ha de fer en quatre
tubs diferents, un per cada nucleòtid, cosa que ens donarà informació sobre les posicions
en les quals era present aquest nucleòtid determinat en la seqüència original. Per
a acabar d'obtenir aquesta informació és necessari separar els fragments d'ADN dels
quatre grups en un gel de poliacrilamida en format capil·lar (electroforesi capil·lar)
i, després, visualitzar-lo.
Hi ha una variació d'aquesta tècnica, que és la que actualment s'estén, ja que és
més barata i senzilla, i de la qual exposem un exemple dels resultats en la figura
següent.
En aquest segon mètode no és necessari utilitzar quatre reaccions per mostra, sinó
només una. Això s'aconsegueix marcant els quatre dideoxinucleòtids amb un marcador
fluorescent diferent, els quals emeten fluorescència a diferent longitud d'ona. Tanmateix,
en aquest cas, l'amplificació de l'ADN (PCR) es produeix simultàniament a la incorporació
dels dideoxinucleòtids en cada cicle de la reacció de PCR. De manera semblant al cas
anterior, és necessari separar els fragments mitjançant una electroforesi capil·lar.
La visualització dels fragments es produeix de manera automàtica mitjançant un làser
que activa els fluoròfors, i un sistema de recollida de les dades de fluorescència.
Amb aquest sistema es pot analitzar en una mateixa reacció fins a uns 1.000 parells
de bases aproximadament.
En cas que es pretengui seqüenciar fragments d'ARN, i atès que l'estabilitat d'aquesta
molècula és molt més petita que la de l'ADN, cal fabricar primer una cadena d'ADN
complementari. Això s'aconsegueix mitjançant una reacció en la qual intervé l'enzim
transcriptasa inversa, la qual forma una seqüència d'una única cadena d'ADN complementària
a la d'ARN (ADNc). Després d'aquest pas, es pot seqüenciar tal com s'ha descrit anteriorment.
Els nucleòtids, marcats amb quatre possibles fluoròfors, fan de terminador de la cadena
d'ADN que es va sintetitzant, creant fragments de diferent mida que es van llegint
a mesura que avancen el gel capil·lar, i són representats després mitjançant quatre
colors diferents. Observeu que on indica la fletxa hi ha una guanina i una timina
(vermell i blau) superposades en la mateixa posició (mutació G2019S del gen dardarin
causant de la malaltia de Parkinson).
Hi ha altres mètodes per a seqüenciar l'ADN, per exemple el de la piroseqüenciació.
Essencialment, i igual que en els casos anteriors, un oligonucleòtid fa d'iniciador
per a la fabricació d'una cadena nova d'ADN. Els diferents nucleòtids es van afegint
seqüencialment d'un en un, juntament amb una barreja enzimàtica. Cada vegada que un
nucleòtid és incorporat a la cadena naixent s'origina una sèrie de reaccions enzimàtiques
que produeixen una radiació lluminosa. Una càmera recull i quantifica la quantitat
de llum emesa, la qual cosa ens dirà si la incorporació d'un nucleòtid a aquesta posició
de l'ADN ha tingut lloc o no. Després, es degraden enzimàticament els nucleòtids no
incorporats o sobrants i es fa un rentatge per a eluir-los (l'ADN no es renta gràcies
al fet que es fixa prèviament en una superfície). Ara, ja es pot afegir el nucleòtid
següent juntament amb la seva barreja enzimàtica, i així successivament. Tot aquest
procés es fa de manera automàtica, i es poden arribar a seqüenciar en la mateixa reacció
fins a unes 100 de parelles de bases. Les seves aplicacions també inclouen el genotipatge
de polimorfismes coneguts, canvis en la metilació de l'ADN i quantificació al·lèlica
que permet detectar-ne duplicacions i delecions gèniques.
Els nucleòtids són afegits seqüencialment un per un, i en ordre G C T A, de manera
que quan apareix un pic de llum significa que s'ha incorporat aquest nucleòtid a la
cadena naixent d'ADN. En la tercera posició no apareix cap senyal corresponent a la
timina perquè en aquesta posició no hi ha una adenina a la cadena complementària d'ADN,
sinó una timina (ja que s'ha incorporat una adenina que es veu en el tercer pic).
El quart pic (després d'eluir la timina anterior) registra el doble d'intensitat a
causa que s'han ajuntat els senyals de dues guanines successives, i una cosa similar
succeeix amb el cinquè pic. Finalment, la seqüència serà GCAGGCCT.
Hi ha altres mètodes d'anàlisi genètica que s'utilitzen perquè tenen un cost més baix
i són fàcils d'analitzar que estudiarem en els apartats següents.
2.3.2.Anàlisi de conformació de cadena senzilla (SSCP)
La tècnica d'anàlisi de conformació de cadena senzilla (SSCP, o single-strand conformation polymorphism) es basa en els canvis de conformació tridimensional que presenten dues cadenes senzilles
d'ADN que difereixen entre elles en un únic nucleòtid. Aquests canvis de conformació
es poden posar de manifest en un gel d'acrilamida mitjançant l'aparició d'un patró
de bandes diferencial entre les mostres control i les mostres problema.
Primer, s'amplifiquen mitjançant PCR els fragments de l'ADN que s'ha d'estudiar. S'ha
d'intentar que els fragments no sobrepassin els 200 bp, o en cas contrari es perd
sensibilitat per a detectar-ne les mutacions. Els productes amplificats es desnaturalitzen
mitjançant calor i en un medi amb formamida, per a analitzar-lo seguidament mitjançant
electroforesi en un gel d'acrilamida juntament amb mostres de controls sans i sense
mutacions. En desnaturalitzar-se, l'ADN monocadena adquireix una o diverses conformacions
determinades, que són les més estables termodinàmicament en les condicions particulars
en les quals es fa l'experiment. Una mutació pot alterar aquesta estructura, modificant
la facilitat amb què es desplaça al llarg del gel d'electroforesi. L'aparició d'un
patró de bandes anòmal és indicativa d'un possible canvi de nucleòtid. Això ha de
ser confirmat posteriorment mitjançant una seqüenciació directa. L'ús de l'SSCP proporciona
una primera aproximació a l'anàlisi mutacional de manera ràpida i barata.
2.3.3.Anàlisi d'heterodúplex
Aquest mètode és similar a l'anterior, llevat que en aquest cas, després de desnaturalitzar
les cadenes d'ADN, deixarem que es vagi refredant a poc a poc. D'aquesta manera, les
monocadenes d'ADN es tornaran a renaturalitzar, amb la particularitat que algunes
cadenes canviades s'hauran unit a d'altres no canviades (heterodúplex), amb la qual
cosa les dues cadenes seran homòlogues, excepte en un nucleòtid. Aquesta discordança
de nucleòtids desacoblats en aquest lloc pot crear una alteració lleugera en l'estructura
de la doble cadena de manera que tingui conseqüències en la mobilitat electroforètica
(Ravnik-Glavac et al., 1994).
Inicialment, tindrem la situació de a), en què totes les bases estan correctament acoblades amb la seva complementària (homodúplex).
Després de la desnaturalització de les dobles cadenes, i la seva renaturalització
posterior a l'atzar de les cadenes complementàries, la meitat de les molècules es
trobarà en estat d'homodúplex (a) i l'altra meitat en estat heterodúplex (b). En heterodúplex una de les bases no es pot acoblar correctament amb la seva complementària
creant-se una lleugera separació entre cadenes en aquest punt, la qual tindrà conseqüències
en la mobilitat electroforètica que podrem observar.
Fins aquí, s'han descrit mètodes per a detectar mutacions no conegudes. Quan la mutació
o polimorfisme ja han estat caracteritzats i se'n coneix la base molecular, és possible
dissenyar estratègies diagnòstiques basades en la detecció d'aquesta seqüència canviada
concreta com les que s'expliquen seguidament.
El genotipatge o especificació d'un polimorfisme se sol fer utilitzant mètodes basats
en diferents principis: segons el canvi en les propietats fisicoquímiques del fragment
d'ADN que origina aquest canvi genètic, mitjançant la hibridació específica d'un fragment
i d'ADN (o oligonucleòtid) a cada al·lel, o bé mitjançant reconeixement enzimàtic
de seqüències determinades.
2.3.4.Determinació de polimorfismes mitjançant anàlisi de restricció (PCR-RFLP)
La tècnica de la PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) per a la determinació dels genotips d'un polimorfisme es basa en l'amplificació
d'un segment d'ADN i la seva exposició posterior a un enzim de restricció determinada.
Un enzim de restricció (o endonucleasa de restricció) és un enzim que pot reconèixer
una seqüència determinada de nucleòtids dins d'una molècula d'ADN i tallar-la en un
punt concret anomenat lloc o diana de restricció, el qual depèn de l'enzim utilitzat. Els llocs de restricció reconeixen seqüències
entre 4 i 12 parells de bases. El tall de l'ADN es fa trencant 2 enllaços fosfat en
la doble cadena, cosa que dóna lloc a dos fragments, que poden ser roms o cohesius.
Aquests últims tenen tendència a tornar a hibridar de manera espontània, ja que els
extrems d'un fragment trencat es poden unir en els altres extrems coincidents d'un
altre fragment trencat mitjançant ponts d'hidrogen. Però seguim, el que de veritat
ens interessa de les propietats d'aquests enzims és que mitjançant elles es poden
discriminar mutacions, ja que canvis de nucleòtids o petites delecions/insercions
poden produir la pèrdua d'una diana o l'aparició d'una nova diana on abans de la mutació
aquesta no existia (Roberts, 1981). Una vegada feta la digestió de l'ADN és necessari
discriminar en quines mostres s'ha produït la ruptura del fragment en qüestió, i en
quines no. Per a això, es duu a terme una electroforesi i es visualitza mitjançant
una tinció posterior.
N significa un nucleòtid indeterminat. Les fletxes indiquen els llocs de tall. Aquesta
foto correspon a la visualització d'un polimorfisme descrit en el gen saitohin, el
qual s'inclou en l'haplotip del gen tau que incrementa el risc de sofrir paràlisi
progressiva supranuclear i malaltia de Parkinson (Ezquerra et al., 2005). El fragment de PCR original es correspon amb una mida d'una mica més de
700 bp. Quan l'al·lel A és present en ambdues cadenes d'ADN, l'enzim talla en unes
altres dues zones de la seqüència i produeix tres fragments diferents de 309, 242
i 194 bp. Quan l'al·lel G és present en una de les cadenes, apareix una banda extra
de 97 bp, a causa que el fragment de 194 bp es talla per la meitat. Si l'al·lel G
és present a les dues cadenes, el fragment de 194 bp no s'observa.
2.3.5.Amplificació múltiple (PCR múltiplex)
En alguns casos, ocorren delecions d'alguns exons o de fragments grans dins d'un gen.
Per a la seva detecció, s'amplifiquen mitjançant PCR i de manera simultània diferents
fragments de diferents gens en un sol tub (múltiplex), utilitzant parelles d'encebadors
o oligonucleòtids prèviament optimitzats per a cadascun dels fragments d'ADN. El resultat
de cada PCR múltiplex s'analitza mitjançant electroforesi i se n'obté un patró de
bandes a partir del qual és possible inferir les regions delecionades. És un mètode
molt ràpid i barat, però limitat, en el sentit que sols es poden detectar mutacions
homozigotes. És apropiat, per exemple, per a la recerca de delecions al cromosoma
Y (ja que hi ha un sol cromosoma). Per a la detecció de delecions heterozigotes és
necessària la utilització d'altres mètodes quantitatius o semiquantitatius.
2.3.6.Amplificació múltiple dependent de lligació de la sonda
Aquesta tècnica és aplicable tant a la recerca de mutacions puntuals o SNP, com a
delecions o insercions de fragments d'ADN, i permet la realització de diverses desenes
d'anàlisis genètiques o assajos d'una mostra i alhora en un mateix tub (Scarciolla
et al., 2007). En aquesta tècnica no és la mostra d'ADN genòmic la que s'amplifica mitjançant
PCR, sinó els dos parells de sondes que s'hibriden en l'ADN. L'amplificació específica
dels parells de sondes dependrà de la presència de les seqüències complementàries
en l'ADN. Per a cadascun dels assajos, es dissenyen dos oligonucleòtids, de manera
que en hibridar sobre la seqüència d'ADN diana poden ser lligats enzimàticament entre
ells (vegeu la figura següent). Tots els parells de sondes tenen seqüències idèntiques
en els extrems 5' i 3', respectivament; d'aquesta manera, és possible l'amplificació
simultània de tots els assajos amb un sol parell d'oligonucleòtids mestres. Un d'aquests
oligonucleòtids mestres estarà marcat amb un fluoròfor.
Els fragments resultants de les diferents amplificacions tindran mides diferents (de
100 a 500 parells de bases aproximadament), amb la qual cosa es podran distingir separant-los
mitjançant una electroforesi i utilitzant els aparells automàtics adequats. L'àrea
dels pics de cadascun dels fragments es mesura automàticament mitjançant l'aparellatge
adequat.
La normalització dels resultats es fa calculant la proporció de l'àrea de cada fragment
amb la suma del senyal dels altres fragments. D'aquesta manera, estem fent una quantificació
relativa de cada assaig, i podrem testar la possible presència de delecions o duplicacions
gèniques.
A més, també és possible identificar SNP, utilitzant dues sondes que només difereixen
entre elles en l'últim nucleòtid, en la posició en què suposadament hi ha el polimorfisme.
Com que perquè hi hagi amplificació mitjançant PCR és necessari una lligació prèvia
dels extrems de les sondes, és necessari que ambdues sondes hibridin amb l'ADN mostra
particularment en aquesta posició. Així, per a un heterozigot, una sonda amplificarà
un dels al·lels del polimorfisme mentre que l'altra sonda només n'amplificarà l'altre
al·lel. Ho entendrem millor amb l'esquema següent:
Esquema del funcionament de l'amplificació múltiple dependent de lligació de la sonda,
en aquest cas per a detectar un polimorfisme tipus SNP. A) Per a cada SNP són presents tres sondes diferents d'ADN que hibriden amb la seqüència
diana d'ADN del pacient, amb l'excepció que dues d'elles són específiques d'al·lel
(A o C en l'última posició). B) Una sonda o l'altra s'hibriden sobre l'ADN depenent del polimorfisme present a cada
cadena i una ligasa uneix ambdues sondes. C) Cadascuna de les sondes de cada assaig té una seqüència comuna X i Y, respectivament,
en els extrems 5' i 3' (marcada en blau), que és utilitzada de motlle per a l'amplificació
mitjançant PCR utilitzant els oligonucleòtids F i R (en vermell). Finalment, obtindrem
dos fragments d'ADN diferents (en aquest cas) que serien visualitzades en un gel d'acrilamida
i que seran indicatives del polimorfisme present a la mostra.
2.3.7.Determinació de polimorfismes microsatèl·lits
Els polimorfismes microsatèl·lits (o STR, acrònim de short tandem repeats) són compostos per seqüències bàsiques de 2-4 nucleòtids, la repetició dels quals
en tàndem origina sovint seqüències de menys de 150 nucleòtids. S'estima que el genoma
humà conté uns 200.000 microsatèl·lits, que es distribueixen més o menys homogèniament,
la qual cosa juntament amb la propietat que són multial·lèlics els fa idonis per a
dur a terme estudis d'anàlisi de lligament genètic en famílies. Les mutacions inestables
són un tipus específic de microsatèl·lits, i consisteixen en l'"expansió" o l'augment
d'unitats de repetició de nucleòtids (especialment, CA i CAG). S'han identificat aquest
tipus de repeticions en diversos gens humans associats a un nombre important de patologies
neurològiques (3) . Aquestes repeticions de trinucleòtids o dinucleòtids es troben en persones sanes,
però en un nombre més petit que en els malalts i poden variar de nombre d'una generació
a l'altra, per això es diuen mutacions dinàmiques. El nombre de repeticions pot anar creixent d'una generació a l'altra fins que els
seus efectes patogènics es manifesten. A més, l'edat d'inici de la malaltia i gravetat
de la presentació clínica se sol correlacionar positivament amb el nombre de repeticions.
Per a determinar el nombre de repeticions dels microsatèl·lits se sol amplificar mitjançant
PCR un fragment d'ADN que inclogui el polimorfisme en qüestió. Seguidament, el producte
d'aquesta amplificació s'analitza mitjançant electroforesi en un gel d'acrilamida,
juntament amb marcadors de pes molecular, per a determinar la mida de cada fragment,
i així obtenim el genotip de cada individu. La concentració del gel acrilamida sol
ser relativament alta per a poder discriminar fragments d'ADN que es diferencien en
tan sol 2 o 3 bp (Sambrook et al., 2001).
2.3.8.Genotipatge mitjançant sondes TaqMan
Aquest és un altre mètode per a genotipar que s'ha estès ràpidament per la seva senzillesa
i rapidesa. Per a això, s'utilitzen les anomenades sondes TaqMan (D. Whitcombe, 1998). Mitjançant dos oligonucleòtids, s'amplifica el segment d'ADN
en el qual es troba el polimorfisme diana. A més, són presents dues sondes TaqMan
d'unes 10-15 pb que són complementàries de la regió concreta del fragment d'ADN adjacent
al polimorfisme, i que sols es diferencien en un nucleòtid (corresponent als dos al·lels
del polimorfisme). Cadascuna de les dues sondes està marcada amb un fluoròfor diferent
en la part 5', i cadascuna d'elles hibrida respectivament amb cadascun dels al·lels
d'un polimorfisme determinat. Cadascuna de les sondes té en la seva part 3' un quencher, o neutralitzador, que fa que el fluoròfor no emeti fluorescència en estar unit a
l'oligonucleòtid. L'MGB o minor grove binding intensifica l'especificitat de la unió de les sondes a l'ADN.
Quan la sonda marcada hibrida amb l'ADN dins d'un cicle de PCR, l'activitat 5'exonucleasa
provoca l'alliberament del fluoròfor i deixa d'estar en contacte amb el neutralitzador,
i llavors emet fluorescència. Tanmateix, si alguna de les dues sondes hibridades té
un nucleòtid desacoblat (en el lloc del polimorfisme) és molt menys probable que la
polimerasa pugui degradar la sonda, per tant, no emet fluorescència i simplement la
sonda és desplaçada de la cadena d'ADN. Gràcies a l'especificitat de les sondes i
a l'activitat 5'exonucleasa de la Taq polimerasa, és possible determinar el genotip.
Mitjançant la detecció de la diferent fluorescència emesa per cadascuna de les sondes
al final dels 40 cicles de la PCR podem conèixer quin és el genotip del polimorfisme.
En cada reacció s'analitza un únic SNP i la reacció es fa en plaques de 96 o de 384
vasets.
Aquesta tecnologia es pot aplicar utilitzant els circuits integrats fluídics d'ADN.
Aquests circuits fan servir una xarxa de canals integrats i vàlvules que divideixen
les mostres d'ADN i els reactius de PCR. Les mostres es dilueixen i es barregen amb
els reactius dins del xip de manera automàtica, i es poden aconseguir uns quants milers
de genotips per circuit sense necessitat de carregar a mà tots els vasets. Les seves
aplicacions poden incloure, a més, la quantificació gènica que veurem més endavant.
2.3.9.Xips d'ADN per a genotipatge a gran escala
Fins aquí hem explicat els mètodes comuns de genotipatge que podien ajudar a trobar
mutacions o polimorfismes relacionats amb les malalties o amb un fenotip (4) determinat. Ara bé, tot això es basava en el fet que teníem una idea prèvia de quins
gens estaven associats a cada malaltia. Tanmateix, en molts estudis no es parteix
d'una idea a priori de quins gens poden estar involucrats en cada fenotip. En aquests casos, es pot fer
una anàlisi d'associació a gran escala, això és, analitzar centenars de milers d'SNP
distribuïts uniformement per tot el genoma en centenars de controls i pacients per
a comparar, posteriorment, les freqüències genotípiques en els dos grups. També es
pot utilitzar aquesta tècnica per a fer estudis d'anàlisi de lligament genètic en
famílies.
En aquest tipus d'anàlisi no es parteix d'una hipòtesi de partida sobre quins gens
candidats poden estar involucrats en un procés patològic determinat, sinó que es fa
una anàlisi massiva del genoma. Per a dur a terme aquest tipus d'estudis es necessita
una tecnologia que pugui fer això d'una forma raonablement ràpida i econòmica. En
els últims anys, s'han desenvolupat xips d'ADN que poden genotipar centenars de milers
de polimorfismes alhora.
En línies generals, el procés consisteix a digerir l'ADN del subjecte amb enzims de
restricció per a fragmentar-lo a una mida determinada i, posteriorment, aquests fragments
es lliguen a adaptadors d'ADN amb els quals es poden amplificar els fragments posteriorment
mitjançant PCR. Aquests fragments d'ADN són marcats, són desnaturalitzats i són hibridats
posteriorment al xip. Aquests xips d'ADN són fabricats usant una gran varietat de
tecnologies, i mitjançant processos automàtics que alineen cadascuna de les sondes
per als diferents polimorfismes en punts que se separen els uns dels altres per distàncies
microscòpiques. A grans trets, per a fabricar un d'aquests xips se sintetitzen sondes
d'ADN d'unes 25 bases i es fixen a un suport sòlid. Aquestes sondes són complementàries
de la regió gènica que es vol analitzar, una d'elles coincideix exactament en el centre
amb un al·lel d'un polimorfisme i l'altra sonda coincideix exactament amb l'altre
al·lel, de manera que cada sonda hibrida amb la seqüència d'ADN amb l'al·lel corresponent.
En realitat, per a comprovar que es compleix aquesta especificitat s'utilitzen diverses
desenes de sondes per a cada al·lel: utilitzant sondes que no coincideixen per a cap
dels dos al·lels, analitzant les dues cadenes d'ADN (amb sentit i sense sentit), i
posant en altres posicions flanquejants bases no coincidents com a controls negatius.
Després del procés d'hibridació, el xip es renta, es tenyeix i s'escaneja per a detectar
el senyal fluorescent en cada posició, i així determinar el genotip de cada polimorfisme
(Kozal et al., 1996). L'anàlisi posterior d'aquests resultats és un procés estadístic complex,
en el qual no aprofundirem en aquest mòdul.
2.4.Estudis d'expressió gènica
La presència de polimorfismes en una seqüència d'ADN i/o l'exposició a alguns factors
ambientals poden alterar la quantitat expressada de determinats gens. Així, el nivell
al qual convergeixen la genètica i els factors ambientals és l'expressió gènica. D'aquesta
manera, el perfil d'expressió en el cervell podria ser més informatiu sobre l'etiologia
dels comportaments complexos que l'estudi dels factors genètics i ambientals separadament.
Però a més, aquestes tècniques quantitatives també es poden emprar per a detectar
mutacions en l'ADN per duplicació o depleció d'exons.
2.4.1.Anàlisi de l'expressió mitjançant PCR quantitativa
Mètodes descrits anteriorment, com el Northern blot, piroseqüenciació o xips d'ADN, es poden utilitzar per a quantificar la quantitat
d'àcids nucleics presents en una mostra. Tanmateix, el mètode més estès i sensible
és la tècnica de la PCR quantitativa a temps real, utilitzant sondes TaqMan. Per a
això, s'utilitza la mateixa tecnologia explicada en l'apartat 2.3.8, tot i que en
aquell cas s'observava la fluorescència al final dels cicles de PCR, i en aquest mètode
és necessari anar observant l'increment de fluorescència en cada cicle.
En comptes de sondes TaqMan es pot utilitzar el reactiu SYBR green, el qual és un
agent intercalant que s'uneix de forma estequiomètrica a l'ADN de doble cadena, que
llavors és fluorescent. Tanmateix, aquest sistema pot ser més problemàtic, ja que
el SYBR green es pot unir a productes de PCR no específics (inclosos artefactes presents
en les PCR coneguts com a dímers d'oligonucleòtids) que poden interferir en la quantificació
específica del fragment d'ADN que estiguem analitzant.
Com s'ha explicat en el subapartat "Reacció en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction: PCR)" el nombre de molècules d'ADN en una PCR s'incrementa teòricament segons la
funció Ni x 2
n
. Així, la concentració relativa d'ADN o ADNc durant la fase exponencial es pot representar
en escala logarítmica en base 2, expressant la quantitat de fluorescència respecte
al nombre de cicles. D'aquesta manera, el creixement exponencial es presenta en forma
d'una recta en una fase de la gràfica. Passat un determinat cicle, i a causa de l'esgotament
dels reactius, la fase exponencial s'atenua i entra en una fase de plateau, estacionària o de punt final (figura següent). La quantitat total de fluorescència
en la fase de plateau depèn més de la quantitat d'oligonucleòtids original, que de la quantitat inicial
d'ADNc que volem quantificar. És, doncs, la fase exponencial la que utilitzem per
a analitzar l'expressió: és la part de la gràfica en la qual realment es compleix
la fórmula Ni x 2
n
. El cicle al qual la fluorescència d'una mostra concreta assoleix un determinat valor
llindar arbitrari (threshold), dins de la fase exponencial, s'anomena Ct (cycle threshold). Com que la quantitat d'ADNc es dobla cada cicle durant la fase exponencial, es
poden calcular els nivells relatius d'una mostra respecte a l'altra. Per exemple,
dues mostres que tinguin una diferència de 4 en el Ct, significa que el que té el
Ct més baix tindria 24 =16 vegades més quantitat d'aquest fragment d'ADNc.
Tanmateix, això és teòric. A la pràctica no n'hi ha prou per a saber si aquest gen
determinat s'expressa més en una mostra que en l'altra, ja que hi pot haver diferències
en la concentració d'ADNc total que hi havia inicialment (Ni), ja sigui per diferències
en l'extracció d'àcids nucleics o per diferències intrínseques d'expressió general
entre les mostres. S'han de normalitzar els resultats utilitzant un control intern,
és a dir, ajustant en funció de la quantitat d'un gen control endogen a cada mostra
(housekeeping gene). Un control endogen seria un gen necessari per al manteniment bàsic de la cèl·lula
i que presumiblement no està subjecte a grans canvis en la regulació de l'expressió,
amb la qual cosa mantindria els seus nivells d'expressió relativament constants. No
sempre és fàcil trobar un gen control adequat, per això és aconsellable utilitzar
la mitjana geomètrica de diversos gens control per a fer-ne la normalització.
La diferència entre el cicle en el qual s'assoleix el valor llindar del gen estudiat
i el valor llindar del gen de control endogen (o de la mitjana geomètrica de diversos
gens control) és:
ΔCt = Ct (gen estudiat) – Ct (gens de control endogen).
També les podem normalitzar respecte a una mostra, escollida arbitràriament, que ens
servirà de referència (mostra calibradora). Així, s'obtindrà la quantitat relativa
del gen estudiat a totes les mostres respecte a la mostra patró utilitzant la fórmula:
ΔΔCt (mostra testada) = ΔCt (mostra testada) – ΔCt (mostra calibradora)
A partir d'aquest valor s'obté fàcilment la informació de quant s'expressa cadascuna
de les mostres amb relació a la mostra calibradora, utilitzant la fórmula 2–ΔΔCt (de Ni x 2
n
). Utilitzant aquests valors de 2–ΔΔCt ja es poden comparar estadísticament l'expressió en els controls amb els casos. Posem
un exemple, estem estudiant l'expressió del gen DRD2 en dues mostres diferents, A
i B, i utilitzem com a control endogen el gen GAPDH. Els valors de Ct en la mostra
A són Ct = 30 per a GAPDH i Ct = 32 per al gen DRD2, mentre que els valors de Ct en
la mostra B són Ct = 32 per a GAPDH i Ct=35 per a DRD2. Quina de les dues mostres
presenta més quantitat relativa del gen DRD2? Aplicant la fórmula anterior, compararem
la mostra B respecte a la A (que hem pres com a referència, arbitràriament): ΔΔCt
(mostra B) = ΔCtB(32 – 30) – ΔCtA(35 – 32) = ΔCt(2) – ΔCt(3)= –1. És un valor negatiu de B, amb la qual cosa en la
mostra A hi ha més quantitat relativa de transcrits de DRD2. Dues vegades més concretament
(2–ΔΔCt= 2–(–1)= 2) .
És possible que l'eficiència de la reacció d'amplificació en un assaig o gen determinat
no sigui del 100%, sinó més petita, per la qual cosa es pot ajustar en la fórmula
2ΔCt. Per exemple, en cas que l'eficiència de molècules amplificades d'un gen en cada
cicle sigui del 90%, llavors es calcularà segons: 0,9 x 2 = 1,8ΔCt.
Per a determinar aquesta eficiència en cada assaig hi ha diferents mètodes. Es poden
fer dilucions seriades d'una mostra per a determinar el Ct en cadascuna d'elles. A
partir d'aquests valors de cada dilució es fa una recta de regressió, i l'eficiència
es calcula mitjançant la fórmula: eficiència = 10–1/pendent de la recta (suposant en aquest cas que les successives dilucions es facin en factor deu).
També hi ha altres mètodes basats en les cinètiques de reacció, en els quals s'analitzen
els valors de fluorescència de cada mostra i en cada cicle. Per a això, s'utilitza
la regressió lineal de la fase exponencial per a calcular directament l'eficiència
en cada mostra, utilitzant la fórmula anterior, i sense necessitat d'utilitzar dilucions
seriades d'una mostra artificial.
Afortunadament, no s'han de fer aquests càlculs manualment. Hi ha alguns programes (5) que fan tots aquests càlculs de l'eficiència de manera senzilla com DART-PCR. Altres
programes com Qbase o GeNex calculen les quantitats relatives de cada gen mitjançant
el mètode ΔΔCt, i es poden utilitzar diversos controls endògens i ajustar l'eficiència
per a cada gen.
El mètode de quantificació gènica relativa és útil en molts casos en els quals el
que es pretén és definir si hi ha alteracions d'expressió entre dos grups de mostres
o més. Tanmateix, per a algunes aplicacions és convenient dur a terme una quantificació
absoluta, és a dir, determinar el nombre de còpies del fragment d'ADNc que hi ha en
una mostra determinada. Per exemple, quan es vol determinar amb exactitud la càrrega
vírica d'un pacient. En aquest cas, haurem de fer ineludiblement una recta patró (regressió)
amb dilucions seriades, a partir d'una mostra de concentració coneguda, i, a partir
d'ella, determinar el nombre de còpies de la mostra que testem (Pfaffl).
2.4.2.Anàlisi d'expressió massiva (microxips)
Igual que en el cas de l'anàlisi d'associació amb SNP, de vegades no es parteix d'una
idea inicial sobre quins gens poden estar involucrats en un tret fenotípic concret,
i és necessari analitzar tots els gens d'un teixit o organisme. Per a això, és necessari
disposar de la tecnologia adequada per a fer-ho a temps i cost raonables. Els xips
d'ADN es poden usar per a detectar ARN en anàlisis d'expressió en les quals poden
ser analitzats milers de transcrits simultàniament. Bàsicament, es basen en la presència
d'oligonucleòtids, ADNc o fragments de PCR complementaris de l'ARNm (o ADNc) de la
mostra, que hibriden, amb aquests de forma específica, per a cada gen en llocs determinats
del xip.
En aquest tipus de xip d'ARN, s'hibrida l'ARNm (o ADNc) de dues mostres diferents
(per exemple, la mateixa quantitat d'ADNc d'un control i un malalt, o bé pools o barreges dels controls i malalts) que són marcats, cadascun d'ells amb un fluoròfor
diferent. La barreja d'ambdós és hibridada amb els oligonucleòtids del mateix xip
d'ADN. Així, obtindrem una quantificació relativa de l'ARN missatger original de cada
gen basada en la diferència de senyal dels dos fluoròfors entre casos i controls.
Finalment, es fan els càlculs estadístics pertinents per a detectar diferències significatives
a partir d'aquests nivells de fluorescència i s'ajusten per a múltiples comparacions
(Bustin et al., 2002). Els gens en els quals observem un increment o decrement significatiu de
l'expressió, comparats amb els controls, es poden validar posteriorment utilitzant
la PCR quantitativa.
2.5.Mètodes d'estudi de modificacions epigenètiques. Metilació de l'ADN
De vegades, algunes característiques heretades no s'originen en canvis en la seqüència
de l'ADN. És el que es coneix com a epigenètica, i es deu, usualment, a la metilació diferencial d'algunes citosines adjacents una
guanina (CpG). Les zones promotores dels gens solen tenir percentatges alts de seqüències
CpG no metilats. Tanmateix, de vegades es produeix una metilació d'aquestes zones
que origina que se silenciï l'expressió d'aquests gens, i que provoca en alguns casos
processos patològics (Schumacher et al., 2006). Aquestes alteracions es poden estudiar mitjançant diversos mètodes. Explicarem
les tècniques més comunes:
2.5.1.Digestió amb enzims de restricció sensibles a metilació
Alguns enzims de restricció no solament tallen l'ADN genòmic amb una seqüència determinada,
sinó que necessiten que hi hagi algunes citosines metilades en posicions concretes.
Posteriorment, el patró de metilació diferencial del fragment d'ADN d'interès s'analitza
mitjançant Southern. D'aquesta manera, es poden detectar també patrons de metilació
parcials.
2.5.2.Conversió de l'ADN mitjançant bisulfit
El tractament d'ADN amb bisulfit de sodi pot convertir les citosines no metilades
en uracils. Els uracils són un tipus de bases nitrogenades que substitueixen les timines
de l'ADN en l'ARN, i s'hibriden amb les adenines. Tanmateix, les citosines metilades
són immunes a la conversió en uracils per bisulfits. Així, aquesta tècnica permet
la determinació del patró de metilació comparant mostres tractades amb no tractades.
Per a això, les mostres se sotmeten al procés d'exposició al bisulfit i després s'amplifiquen
mitjançant PCR, com a pas previ a la seqüenciació. Això es pot fer en mostres de casos
i controls per a la seva comparació entre elles (Clark et al., 2006).
3.Mètodes d'estudi en models animals
3.1.Models animals utilitzats en psicogenètica
La genètica necessita models animals que li permetin estudiar trets i processos, utilitzant
mètodes que seria impossible utilitzar amb éssers humans, no només per motius ètics sinó també a causa de limitacions temporals.
Els models animals permeten, entre altres coses, aïllar fenotips, fer cria utilitzant
subjectes consanguinis, incloure o excloure gens del genoma dels subjectes experimentals,
clonar subjectes, sobreexpressar productes biològics, etcètera.
En psicogenètica, les principals estratègies d'estudi utilitzant animals són quatre:
1) Estudis dels trets entre diferents soques d'una mateixa espècie.
2) Els estudis per mitjà de les mutacions espontànies.
3) Potenciació de trets fenotípics sense manipulació genètica.
4) Ús de tècniques de manipulació genètica.
El genoma dels animals utilitzats en el primer, segon i tercer tipus d'estudis es
poden analitzar (cariotipatge, PCR, QTL, xips d'ADN...) amb l'objectiu d'estudiar
els patrons d'expressió gènica i trobar gens potencialment implicats en l'expressió
d'un tret (gens candidats). A partir dels resultats obtinguts d'aquests tres tipus
de models animals, s'obté informació valuosa que pot ser útil a l'hora de decidir
quins gens s'haurien de manipular genèticament per a estudiar amb més profunditat
un tret determinat (estudis del quart tipus). En l'apartat 3.2 veurem alguns exemples
pràctics d'aquesta interacció entre les tècniques de genètica molecular i els models
animals.
Els estudis genètics utilitzen diferents organismes per als seus estudis, com bacteris,
llevats, mosques, cucs, peixos i diversos tipus de mamífers (rosegadors, conills,
ovelles). En el cas de la psicogenètica, les espècies més utilitzades són els rosegadors,
tant rates com ratolins.
Els animals més utilitzats en psicogenètica són els rosegadors.
|
Avantatges de l'ús de rosegadors en psicogenètica
|
Desavantatges de l'ús de rosegadors en psicogenètica
|
|---|---|
|
|
3.1.1.Estudis de les diferències entre soques d'una mateixa espècie
Sempre que s'esculli treballar amb rosegadors, cal tenir en compte que hi ha diferents
soques (races) de rates/ratolins cadascuna amb les seves pròpies característiques
conductuals, la qual cosa pot influir en els resultats obtinguts.
La comparació conductual de l'expressió d'un tret (per exemple, agressivitat) entre
soques ens permet saber si hi ha una càrrega genètica en aquest tret: si en comparar
l'expressió d'un tret en dues o més soques d'una mateixa espècie criades al mateix
ambient observem diferències entre les soques, podem afirmar que les diferències es
deuen a components genètics. A més, en comparar els genotips d'aquestes soques podem
trobar variacions al·lèliques que expliquin les diferències fenotípiques observades.
La soca de rates Wistar és la més dòcil, mentre que la soca Long-Evans és la més agressiva.
3.1.2.Estudis per mitjà de mutacions genètiques espontànies
L'aparició d'animals que presenten mutacions de manera espontània en el seu genoma
pot ajudar en l'estudi dels trets o processos psicobiològics.
Coneixent el fenotip normal dels subjectes d'una espècie, podem detectar aquells que
són portadors de mutacions. Es pot tractar d'alteracions genètiques que es detectin
ja que es manifesten físicament (per exemple, albinisme), alterin els mecanismes fisiològics
(alteracions en la síntesi de proteïnes o hormones) o que es tradueixin en canvis
conductuals (per exemple, més ansietat).
Una vegada detectada la mutació fenotípicament, amb tècniques moleculars es poden
detectar les regions del genoma mutades i identificar amb precisió els gens implicats
en el tret/procés que fenotípicament apareix alterat.
Els resultats obtinguts de l'anàlisi d'animals que presenten mutacions espontànies
ens poden orientar en l'estudi genètic de la conducta, i presentar gens candidats
a la regulació d'un fenotip.
3.1.3.Models clàssics en psicogenètica: abordatges des del fenotip
La recerca en psicogenètica va començar utilitzant models animals que no implicaven
cap tipus de manipulació genètica i que es basen en aparellaments programats. D'aquesta
manera, s'aconseguia aïllar fenotips concrets i així els gens associats a aquests
fenotips.
Hi ha dues estratègies: la cria selectiva i les soques consanguínies.
Els models basats en la potenciació de fenotips no impliquen manipulació genètica.
El seu abordatge és des del fenotip al gen.
1) Cria selectiva o selecció artificial
Mitjançant aquest procediment, es persegueix obtenir línies d'animals extrems per
a una característica fenotípica. En el cas de la psicogenètica, el més interessant
és criar dues línies oposades per a un tret per a poder comparar els seus genotips.
Per a això, es parteix d'una població heterogènia, de manera que hi siguin representats
tots els gens, la qual s'avalua per al tret que es vol seleccionar, per exemple: la
intel·ligència. En aquest cas, i tractant-se de rosegadors, es podria utilitzar un
laberint de Tolman.
A partir de les puntuacions obtingudes, s'escullen aquells subjectes que tenen puntuacions més extremes per a aquest tret i s'agrupen en funció dels resultats en dos grups oposats (grup
d'animals més llestos i grup d'animals més maldestres). Una vegada fets els grups
oposats, s'aparellen els animals de cada grup entre ells. Amb les cries nascudes es
repeteix el mateix procediment durant generacions successives (unes 20), evitant aparellaments
consanguinis.
Si el tret estudiat depèn de factors genètics, després de diverses generacions aconseguim
fenotips oposats en les soques seleccionades: una línia d'animals extremadament llestos
contra una línia d'animals extremadament maldestres.
Malgrat que s'eviten els aparellaments consanguinis, els subjectes que pertanyen a
la mateixa línia comparteixen una homozigosi aproximada del 60% dels seus al·lels.
|
Avantatges de la cria selectiva
|
Desavantatges de la cria selectiva
|
|
|
|
Consideracions de la cria selectiva
|
|
|
|
La cria selectiva és una metodologia basada en el fenotip: se seleccionen els animals
amb puntuacions extremes per a un tret per a crear dues línies oposades per a aquest
fenotip.
2) Soques consanguínies
Aquest tipus de cria selectiva pretén obtenir subjectes homozigòtics per a tots els
loci després d'aparellar germans entre ells i, d'aquesta manera, després de successives
generacions, obtenir subjectes idèntics tant genotípicament com fenotípicament.
Es parteix d'una població general i s'inicien els aparellaments entre germans; les
cries d'aquests germans s'aparellen entre ells, i així successivament, durant aproximadament
unes 20 generacions.
Les diferències individuals dins d'una soca es deuen a factors ambientals. En canvi,
quan es comparen dues soques inbred diferents que viuen en el mateix ambient, les diferències entre aquestes posen de
manifest influències genètiques per a la conducta estudiada.
|
Avantatges de les soques inbred
|
Desavantatges de les soques inbred
|
|
|
|
Consideracions de les soques inbred
|
|
|
|
Les soques consanguínies és una metodologia que pretén aconseguir subjectes homozigòtics
per a tots els loci mitjançant aparellaments entre germans.
3) Recombinació de soques consanguínies
Es basa a aparellar animals de dues soques consanguínies, preferiblement amb fenotips
oposats, seguit d'uns vint aparellaments consanguinis entre germans i germanes, de
manera que els cromosomes es recombinen diverses vegades, cosa que dóna lloc a un
únic patró de recombinants dels cromosomes de cada soca. A partir de la utilització
d'aquesta tècnica, es poden fer mapes genètics de la localització de diferents gens
utilitzant enzims de restricció i polimorfismes genètics.
Les soques consanguínies es poden recombinar per a crear mapes genètics.
3.1.4.Models amb animals manipulats genèticament: abordatge des del genotip
Les tècniques de manipulació genètica recents han permès alterar a voluntat el genotip
dels individus, tant excloent gens com fent que els gens s'expressin en moments determinats,
com introduint gens d'una espècie en d'altres. L'objectiu d'aquestes manipulacions
és observar aïlladament la influència d'un gen sobre el fenotip. Els animals que se
solen utilitzar per a aquest tipus de manipulacions són els ratolins (models murins),
ja que el genoma d'aquesta espècie està àmpliament caracteritzat.
Les tècniques de manipulació genètica impliquen introduir canvis en el genoma dels
subjectes experimentals. El seu abordatge és des del gen al fenotip.
Les principals tècniques utilitzades per la psicogenètica són l'eliminació de gens
(knock-out) i la introducció de gens d'una espècie en l'altra (transgènics).
1) Animals knock-out
Aquesta tècnica permet inactivar/silenciar l'expressió d'un gen (gen diana); així
es pot observar l'efecte de la falta d'aquest gen en el fenotip. Experimentalment,
es fonamenta en el principi de la recombinació homòloga i en la utilització de cèl·lules mare embrionàries.
Una vegada escollit el gen que es vol silenciar (gen diana), mitjançant tècniques
d'enginyeria genètica es genera una modificació en alguna de les seqüències del gen
objecte d'estudi que permeti inactivar-lo; normalment, s'escull la seqüència corresponent
a l'exó d'inici del gen. A més de la seqüència que inactivarà el gen diana, s'afegeixen
dos gens més, un de selecció positiva i un altre de selecció negativa. El gen de selecció
positiva és un gen resistent als antibiòtics (normalment el gen Neo, resistent a la
neomicina), que s'insereix dins de la zona de recombinació, i el de selecció negativa
sol ser el gen timidina quinasa del virus de l'herpes (HSV-tk), que se situa en l'extrem
de la seqüència, fora de la zona de recombinació homòloga. Tota aquesta seqüència
manipulada s'introdueix en un vector, normalment un retrovirus.
Retrovirus
En enginyeria genètica els vectors són els sistemes que s'utilitzen per a inserir
l'ADN manipulat en el genoma d'una cèl·lula. Els vectors més utilitzats són els virus
i els plàsmids. Dins de la família dels virus, els més utilitzats com a vectors són
els retrovirus, que, per transcripció retrògrada, converteixen el seu ARN en ADN que
insereixen en el genoma de la cèl·lula hoste. Els enginyers genètics extreuen dels
retrovirus el seu material genètic i el substitueixen per les seqüències modificades
que volen inserir, i només aprofiten aquelles seqüències víriques que permeten introduir
seqüències d'ADN en genoma de les cèl·lules hoste.
Una vegada que el vector està preparat, es fa una extracció de cèl·lules mare embrionàries
(embrionic stem cells), obtingudes de blastòcits de rosegadors gestants i mantingudes en cultiu. Aquestes
cèl·lules se sotmeten a un xoc elèctric que obrirà un porus a la membrana cel·lular
(electroporació) pel qual penetrarà el vector. La seqüència mutada que ha estat introduïda
pel vector s'incorpora a la cadena d'ADN de les cèl·lules embrionàries mitjançant
el procés de recombinació homòloga, la qual cosa produeix la substitució pel gen modificat.
Encara que cal tenir en compte que no totes les recombinacions que es produeixin tindran
èxit, per això cal comprovar quines de les cèl·lules són les que han incorporat la
seqüència del vector. Per a això, s'aplica l'antibiòtic per al qual s'ha introduït
la resistència (neomicina) al cultiu de cèl·lules embrionàries, de manera que moriran
aquelles que no tinguin el gen resistent (selecció positiva) i un agent antivíric
(ganciclovir) que eliminarà les cèl·lules que hagin incorporat la seqüència vírica
(selecció negativa). Les cèl·lules en cultiu que sobreviuran als processos de selecció
seran aquelles que hagin incorporat el gen mutat i s'anomenen recombinants. En aquest pas, es poden utilitzar tècniques de biologia molecular per a comprovar
que realment la seqüència que hem introduït s'ha incorporat a les cèl·lules que han
sobreviscut (Southern, PCR).
Les cèl·lules en les quals s'hagi produït la recombinació amb èxit tindran el gen
diana modificat i el gen de la resistència a l'antibiòtic (selecció positiva) i hauran
perdut la seqüència del gen de la HSV-tk (selecció negativa).
En una segona fase, es microinjecten les cèl·lules embrionàries recombinants en embrions
de ratolí d'un color diferent del de la femella de la qual es van extreure les cèl·lules
embrionàries (per exemple, si la femella donant de les cèl·lules embrionàries és marró,
els embrions poden procedir d'una femella negra). Aquests embrions s'implanten en
femelles pseudoprenyades d'un color diferent de les anteriors (per exemple, blanca).
Les cries que neixin seran formades pels dos tipus de cèl·lules (cèl·lules embrionàries
manipulades i cèl·lules embrionàries sense manipular) i s'anomenen quimeres; és fàcil identificar-les pel seu pelatge (en aquest cas, meitat marró, meitat negre).
De tota manera, s'ha de confirmar el genotip mitjançant tècniques de biologia molecular,
analitzant una mostra de cèl·lules obtingudes de la cua.
L'últim pas consisteix a establir una línia de knock-out. Per a això, s'iniciarà un primer aparellament entre les quimeres i ratolins de la
soca de la qual s'han obtingut els blastòcits (en el nostre exemple, de color negre).
Les cries nascudes d'aquest encreuament que siguin de color marró seran les que portin
el gen modificat (cal tenir en compte que en aquesta primera generació només un 50%
de les cries de les quimeres serà recombinant). Aquests animals s'aparellaran entre
ells per a arribar a generar una línia d'animals en els quals tota la descendència
tingui el gen diana inactivat.
|
Avantatges dels knock out
|
Desavantatges dels knock out
|
|
|
|
Consideracions dels knock out
|
|
|
|
En els animals knock-out s'introdueix una manipulació genètica que inactiva l'expressió d'un gen; així, ens
permet estudiar l'efecte de la seva eliminació sobre el fenotip.
2) Animals transgènics
La creació d'organismes transgènics consisteix a introduir un gen d'una espècie (per
exemple, humana) en el genoma d'una altra espècie (per exemple, ratolins). D'aquesta
manera, es pot aïllar i caracteritzar l'expressió d'aquest gen, cosa que facilita
l'estudi de la seva participació en l'expressió de trets i malalties, així com els
seus mecanismes d'actuació. A més, poden utilitzar-se aquests animals per a provar
nous agents terapèutics.
En aquest cas, la inserció del gen no està dirigida com en el knock-out, sinó que es produeix de manera aleatòria.
Primats transgènics
El 2001, Chang et al. van obtenir el primer primat no humà transgènic. Es tracta d'una mona rhesus denominada Andi (inserted DNA, llegit al revés), que és portadora d'un gen que codifica per a una proteïna verda
fluorescent (la GFP, de l'anglès green fluorescent protein) que s'expressa en diferents teixits. L'ús de primats transgènics seria poc eficient,
ja que el percentatge d'èxit és molt baix (aproximadament del 5%), els seus cicles
reproductius són més llargs que el dels rosegadors i el seu manteniment seria molt
més costós.
En una primera fase, s'aïlla la seqüència d'ADN que conté el gen objecte d'estudi,
anomenat transgèn. Mitjançant tècniques de manipulació genètica, s'afegeix a aquesta seqüència un promotor
propi de l'espècie a la qual injectarem el transgèn per garantir l'expressió gènica.
Encara que aquesta seqüència d'ADN modificada es pot introduir en el genoma del receptor
mitjançant la infecció de cèl·lules mare embrionàries (igual que en el knock-out), la tècnica més utilitzada i eficaç és injectar la seqüència directament en òvuls
fecundats, concretament en el pronucli masculí.
Els embrions/òvuls injectats seran implantats en femelles pseudoprenyades, en les
quals es desenvoluparan. Una vegada nascudes les cries, cal comprovar quines han inclòs
la seqüència d'ADN en el genoma. Per a això, es genotiparan les cries analitzant una
mostra de cèl·lules extretes de la cua.
Amb aquells individus que hagin incorporat el transgèn, s'iniciarà una sèrie d'aparellaments
programats seguint el procediment de cria inbred amb l'objectiu de crear una línia d'animals que presenti el transgèn (se'n requereixen
almenys deu generacions).
|
Avantatges dels transgènics
|
Desavantatges dels transgènics
|
|
|
|
Consideracions dels transgènics
|
|
|
|
En els animals transgènics s'introdueix un gen d'una altra espècie per a poder estudiar,
de manera controlada, la seva expressió, i poder caracteritzar els seus mecanismes
i provar nous agents terapèutics en ells.
3) Altres procediments de manipulació genètica en animals
A continuació, s'apuntaran altres tècniques de manipulació genètica que permeten resoldre
alguns dels problemes que apareixen en els knock-out.
a) Animals knock-out induïts
Per a resoldre el problema de silenciar gens vitals per al desenvolupament, s'ha desenvolupat
la tècnica del knock-out induït. Aquesta tècnica permet silenciar el gen després de l'etapa del desenvolupament,
quan la inactivació del gen no és letal.
Es basa en la mateixa metodologia que els knock-out, però afegint un gen promotor en la seqüència manipulada que s'activa per una substància
(factor de transcripció) que no es troba a l'organisme. Quan el període crític del
desenvolupament ha passat, i l'investigador ho consideri oportú, s'administrarà el
factor de transcripció als animals (injectant-lo o afegint-lo en aigua/menjar) de
manera que s'unirà al promotor iniciant la inactivació del gen diana.
Els knock-out induïts permeten que l'experimentador decideixi el moment en què s'inactivarà el
gen diana.
b) Animals knock-out dirigits
Per a evitar que la desactivació del gen diana afecti tots els tipus cel·lulars de
l'organisme, s'ha desenvolupat el knock-out dirigit, en el qual escollim de manera específica en quin tipus de cèl·lules de l'organisme
no s'expressarà el gen (per exemple, que no s'expressi en neurones dopaminèrgiques).
Com abans, es basa en la metodologia dels knock-out, però en aquest cas el vector que s'introdueixi portarà la seqüència amb el gen diana
manipulat associada a un gen característic del tipus cel·lular que s'inactivarà (en
l'exemple de les neurones dopaminèrgiques, a algun gen associat als enzims de síntesi
del neurotransmissor).
Així es pot estudiar l'absència d'aquest gen només en un tipus cel·lular concret i
no de manera generalitzada, com en el knock-out tradicional.
Els knock-out dirigits permeten que l'experimentador esculli en quin tipus cel·lular concret es
produirà la inactivació del gen diana.
c) Animals knock-in
La tècnica knock-in consisteix a inserir un gen objecte d'estudi en un locus concret del genoma de manera que substitueixi un dels gens de l'organisme receptor.
Així, no es tracta d'inactivar un gen com en el knock-out, sinó de substituir un gen per un altre.
Es basa en la mateixa metodologia que el knock-out convencional, però canvia la composició de la seqüència introduïda en el vector,
de manera que a més del gen que volem silenciar i els gens de selecció positiva/negativa,
afegim una seqüència amb el gen que substituirà el gen silenciat.
Els knock-in permeten introduir un gen en un organisme que substituirà un gen de l'organisme receptor.
d) Animals knock-down
La tècnica del knock-down consisteix a reduir l'expressió d'un gen, sense arribar-lo a inactivar completament.
Per a això, s'introdueix un agent que impedirà els processos de transcripció o traducció
gènica (que actua sobre l'ADN o ARNm segons escaigui). La reducció de l'expressió
gènica pot ser permanent, però també reversible, la qual cosa no implicaria modificacions
en l'ADN cromosòmic (knock-down transitoris).
Els knock-down permeten reduir l'expressió d'un gen, ja sigui de manera definitiva o transitòria.
-
Els models animals permeten fer estudis que per motius ètics i limitacions temporals no és possible fer amb humans.
-
La comparació de soques d'una mateixa espècie ens pot ajudar a trobar variacions gèniques que expliquin les diferències fenotípiques entre elles.
-
L'anàlisi genètica de les mutacions espontànies ajuda a iniciar l'estudi de la implicació de gens concrets en el fenotip.
- Els models clàssics es basen a potenciar trets fenotípics mitjançant aparellaments
selectius, sense implicar cap tipus de manipulació genètica:
-
la cria selectiva es basa a aparellar subjectes amb una mateixa característica fenotípica a fi d'aïllar els gens que participen en aquest tret;
-
les soques consanguínies consisteixen a aparellar germans entre ells a fi que arribin a obtenir subjectes homozigots per a tots els loci.
-
- Les tècniques de manipulació genètica permeten introduir canvis en gens concrets per
a observar quins canvis es produeixen en el fenotip dels subjectes experimentals:
-
la tècnica del knock-out permet inactivar gens i, així, estudiar la seva participació en la conducta;
-
en els transgènics s'introdueix un gen d'una espècie en el genoma de l'espècie receptora de manera que es pot aïllar aquest gen i estudiar els seus mecanismes, així com provar nous agents terapèutics;
-
hi ha variacions d'aquestes tècniques que permeten fer manipulacions més precises com escollir el moment d'inactivació d'un gen (knock-out induït), escollir el tipus de cèl·lules on s'inactivarà un gen (knock-out dirigit), substituir un gen per un altre (knock-in) o reduir l'expressió gènica de manera permanent o transitòria (knock-down).
-
3.2.Utilitats dels models animals en psicogenètica
Com ja es va comentar a l'inici d'aquest apartat, l'ús d'animals aporta grans avantatges
als estudis psicogenètics, i els rosegadors són les espècies més utilitzades amb aquestes
finalitats. D'entre totes les raons que es comentaven, cal destacar dos factors que
fan que sigui un avantatge treballar-hi: l'ampli coneixement tant del genotip com
del fenotip d'aquestes espècies (especialment dels ratolins), i la gran varietat de
publicacions científiques que donen suport a la seva utilització per a l'estudi de
processos psicològics (memòria, aprenentatge...).
En aquest subapartat, es mostraran alguns exemples pràctics de l'ús de models animals en psicogenètica, així com consideracions que s'han de
tenir en compte a l'hora d'utilitzar aquests animals.
3.2.1.Aportacions als estudis de psicogenètica de les soques outbred
El sistema de cria outbred es basa en aparellaments d'individus sense cap tipus de parentiu, ni sota cap criteri
basat en trets fenotípics. D'aquesta manera, s'obté una població heterogènia en la
qual tots els al·lels estarien representats.
Les soques outbred ens permeten dos abordatges: per una part, estudiar la distribució d'un tret en una
població heterogènia, i per l'altra, comparar un tret en races criades en un mateix
ambient; si hi apareguessin variacions, es podrien descartar les variables ambientals
en l'expressió d'aquest tret.
-
Les principals soques de rates outbred són les Wistar, Long-Evans, Sprague-Dawley, OFA, Zurich i Lister-Hooded.
-
Les principals soques de ratolins outbred són els NMRI, Swiss-Webster, CD-1 i OF.
1) Estudi de la distribució d'un tret en poblacions heterogènies
El 2003, De Boer i els seus col·laboradors van estudiar la distribució de la resposta
agressiva en una població outbred de la soca de rates Groening (criada al seu propi laboratori). El paradigma que van
utilitzar va ser el de l'intrús a la colònia i van recollir diferents paràmetres relacionats
amb l'expressió de l'agressivitat (conductes ofensives, exploració social i no social,
inactivitat, conductes de neteja i latència en l'atac). Sobre la base d'aquests paràmetres,
van classificar els nivells d'agressivitat com a baixos, intermedis o alts.
Els investigadors van observar que les rates Groening presentaven una distribució
heterogènia de les conductes agressives, amb subjectes en cadascun dels nivells definits
d'agressivitat.
Un estudi psicogenètic amb animals outbred ens donarà una idea del tipus de distribució que té un tret en la població heterogènia.
Així mateix, aquests autors van estudiar la resposta agressiva de les rates de la
soca Wistar sota el mateix paradigma i van observar que en aquesta soca la distribució
no era heterogènia, ja que mostraven índexs d'agressivitat molt baixos (el 70% dels
animals era en el nivell baix d'agressivitat).
Els resultats d'aquest estudi posen de manifest que hi ha diferències fenotípiques
entre les soques d'una mateixa espècie que s'han de tenir en compte a l'hora de seleccionar
la raça d'animals que millor pugui representar tota la variabilitat del tret que volem
estudiar. Aquestes diferències fenotípiques en una mateixa espècie provenen de variacions
al·lèliques que s'acumulen en cada soca i és típic de comunitats reproductivament
aïllades. En l'espècie humana també es donen aquestes variacions entre races.
2) Estudi de l'efecte de l'ambient compartit i del genoma entre soques d'una mateixa
espècie
Reprenent el fil del que s'ha explicat en el punt anterior i partint del supòsit que
cada soca d'una mateixa espècie té característiques genètiques pròpies, si en un estudi
en el qual es compara l'expressió d'un tret entre diferents soques que comparteixen
ambient s'observen diferències, aquestes es deuran a la variabilitat genètica entre
soques.
Varty i Higgins, el 1994, van avaluar l'execució de la inhibició prepols en tres soques
de rates diferents: Sprague-Dawley, Lister-Hooded i Wistar.
Inhibició prepols
La inhibició prepols es refereix a la disminució del reflex de sobresalt a causa de
la presentació d'un estímul de baixa intensitat just abans de l'estímul que produirà
el sobresalt. S'ha observat que els pacients esquizofrènics no presenten la disminució
de la resposta de sobresalt en tasques prepols, per la qual cosa s'utilitza com a
marcador de la malaltia. En l'àmbit de la farmacologia, s'han creat models animals
d'esquizofrènia que es valoren utilitzant aquesta prova conductual.
Els seus resultats van demostrar que rates de diferents soques criades en un mateix
ambient presentaven diferències en la realització d'aquesta prova, les rates Wistar
eren menys sensibles als senyals prepols, la qual cosa fa pensar que aquest tret associat
a l'esquizofrènia depèn de factors genètics.
Si les soques d'una mateixa espècie, criades en el mateix ambient, presenten diferències
en l'expressió d'un tret, això indica que aquest tret depèn fonamentalment de factors
genètics.
3.2.2.Aportacions a la psicogenètica de les mutacions genètiques espontànies
Com ja es va dir anteriorment, l'aparició de mutacions genètiques espontànies ens
permet detectar els gens implicats en el tret afectat. És necessari conèixer el fenotip
normal d'una espècie per a poder-ne detectar les mutacions quan apareguin (el fenotip
tant físic, com conductual i fisiològic).
Els exemples més paradigmàtics són els estudis mitjançant mutacions espontànies de
dues malalties, l'obesitat i la narcolèpsia.
1) Estudi de l'obesitat mitjançant mutacions genètiques
En la dècada de 1950, l'estudi de l'obesitat es va veure impulsat per l'aparició d'una
ventrada de ratolins que de forma natural eren obesos.
Es va estudiar aquests animals i es va observar que presentaven l'absència d'una hormona
anomenada leptina. Genèticament, es va comprovar que aquests ratolins presentaven
una mutació en una porció del cromosoma 4, en un loci que van denominar ob. Els ratolins obesos presentaven en homozigosi la mutació del gen ob (ob/ob), així que es va relacionar aquesta porció de l'ADN amb la síntesi de leptina.
El 1994, Zhang et al. van demostrar mitjançant tècniques de clonació que efectivament el gen ob participa en la síntesi de leptina, i també que la porció del cromosoma humà 7q31.3
és l'equivalent al gen ob en ratolins.
2) Estudi de la narcolèpsia mitjançant mutacions genètiques
En la dècada de 1960 van aparèixer algunes ventrades de gossos de les races Doberman
i Labrador que mostraven alguns símptomes de la narcolèpsia, més concretament sofrien
atacs de cataplexia (pèrdua sobtada del to muscular sense pèrdua de consciència).
Els estudis genètics van mostrar que aquests gossos tenien una mutació en el cromosoma
12, concretament en la porció que codifica els receptors tipus 2 per a les hipocretines,
unes hormones exclusives de l'hipotàlem que regulen els nivells de vigília. Recentment,
s'ha demostrat que aquesta porció del genoma dels gossos correspon a la porció 6p12-q13
del genoma humà (Li et al., 2001).
Les mutacions genètiques aporten gens candidats a participar en un tret.
3.2.3.Aportacions a la psicogenètica dels models clàssics
Les tècniques d'estudi basades en el fenotip constitueixen els models clàssics en
psicogenètica i són aquells mètodes que sense manipulació genètica permeten aïllar
fenotips.
Els models clàssics permeten, l'estudi comparatiu d'animals clarament oposats per
a un tret, això és una valuosa eina per a detectar les variacions al·lèliques que
participen en els trets estudiats.
1) Estudi comparatiu de trets a partir de fenotips oposats mitjançant línies seleccionades
La cria selectiva ha permès l'aïllament de fenotips concrets. Com ja s'ha comentat,
consisteix a seleccionar els subjectes que obtenen puntuacions extremes per a un tret
i aparellar-los entre ells durant successives generacions. Normalment, es crien dues
línies paral·leles, cadascuna per a un extrem del tret, de manera que les puguem comparar.
Si el tret depèn fonamentalment dels gens, aconseguirem línies d'animals amb fenotips
oposats per a aquest tret. En principi, podríem intentar establir línies per a qualsevol
tret que avaluéssim (la qual cosa no és el mateix que aconseguir línies diferenciades).
Moltes vegades succeeix que hi ha diverses línies d'animals seleccionats per a un
mateix tret, però cal tenir en compte que encara que s'hagi seleccionat el mateix
tret, no vol dir que siguin genèticament iguals. Aquestes línies es poden diferenciar
a causa del següent:
-
La soca de rosegador de la qual s'originin (Wistar, OFA...).
-
El tipus de prova que s'utilitzi per a fer la selecció, ja que cada prova té les seves pròpies característiques i mesura el tret de forma diferencial.
-
Fins i tot utilitzant la mateixa prova es poden fer servir diferents paràmetres per a valorar-la.
Mitjançant la comparació dels genotips oposats obtinguts mitjançant cria selectiva,
és possible identificar gens candidats a participar en la regulació d'un tret.
Alguns dels trets que més s'han seleccionat han estat l'ansietat i l'addicció, que
serviran per a exemplificar els punts que acabem de comentar.
a) Estudi de l'ansietat mitjançant la cria selectiva
Les principals soques de rates ansioses s'han seleccionat partint de la seva execució
en el paradigma d'evitació activa, per això se subdivideixen en evitadores altes i
baixes (high enfront de low avoidance): les Romanes (RHA enfront d'RLA), les Siracusa (SHA enfront d'ALA) i les Australianes
(AHA enfront d'ALA).
Malgrat ser seleccionades sota el mateix paradigma, cadascuna té les seves pròpies
característiques, que es recullen en la taula següent:
Adaptada d'Escorihuela et al., 1994
|
Romanes (RHA/RLA)
|
Siracusa (SHA/SLA)
|
Australianes (AHA/ALA)
|
|
|---|---|---|---|
|
Soca d'origen
|
Wistar
|
Long-Evans
|
Sprague-Dawley
|
|
EC
EI
Temps entre assajos
|
llum (5 segons)
1,6 mA
30 segons
|
llum + so (5 segons)
0,25 mA (35 segons)
1-2 min
|
so (5 segons)
1 mA
30 segons
|
|
Entrenament
|
50 assajos/sessió
5 sessions
|
10 preassajos + 60 assajos en 1 sessió
|
50 assajos
1 sessió
|
|
Criteris de selecció
|
|
|
|
En un estudi del 2005, Zhang et al. van utilitzar les dues línies oposades de les rates Siracusa per a identificar gens
candidats a participar en l'expressió de l'ansietat. Van genotipar animals SHA i SLA
mitjançant microxips d'ARN i RT-PCR quantitativa. Els resultats d'aquesta investigació
van presentar vuit gens candidats, entre ells el gen SLC6a4 situat en el cromosoma
10 i que se sobreexpressava en la línia SLA. Aquest gen està relacionat amb la síntesi
del transportador de la serotonina.
Els autors de l'estudi assenyalen que els seus resultats no coincideixen amb els obtinguts
per altres autors amb les línies Romanes, en què els gens candidats es trobaven en
cromosomes diferents (Fernandez-Teruel et al., 2002).
b) Estudi de l'addicció mitjançant la cria selectiva
Per als estudis d'addicció els criteris de selecció poden realitzar-se en funció d'una
substància determinada (cocaïna, alcohol, benzodiazepines...), la resposta a aquesta
droga (sensibilitat, inducció d'analgèsia, canvis en l'activitat psicomotriu...) o
els efectes a llarg termini (desenvolupament de tolerància, dependència o síndrome
d'abstinència).
En la taula següent hi ha una relació d'algunes de les línies de rosegadors més utilitzades
en l'estudi de les conductes addictives i algun dels criteris de selecció utilitzats
(adaptada de Crabbe et al., 1999):
* mesurat segons la durada del son
# mesurat segons l'activitat locomotora
$ mesurat segons l'atàxia induïda per la droga
& mesurat segons les convulsions durant l'abstinència
# mesurat segons l'activitat locomotora
$ mesurat segons l'atàxia induïda per la droga
& mesurat segons les convulsions durant l'abstinència
|
Criteri de selecció
|
Nom de la línia (abreviatura)
|
|---|---|
|
Sensibilitat inicial a l'alcohol
|
|
|
Tolerància i dependència a l'alcohol
|
|
|
Preferència per begudes amb un 10% d'alcohol enfront d'aigua
|
|
|
Sensibilitat inicial a altres drogues
|
|
L'estudi comparatiu del genoma de dues línies oposades seleccionades pot ajudar en
la recerca de quins són els al·lels implicats en la conducta addictiva. Per exemple,
diversos estudis amb les línies de ratolins LS i SS, seleccionades per la seva sensibilitat
a l'alcohol, va revelar que el polimorfisme A529T del cromosoma 2 (equivalent al cromosoma
20 humà), implicat en la síntesi de la subunitat α4 dels receptors nicotínics, està estretament vinculat amb l'augment del consum de
nicotina i d'alcohol, i també amb el desenvolupament de la síndrome d'abstinència
(Butt et al., 2003).
2) Estudi comparatiu de trets a partir de procediments de cria inbred
Les soques consanguínies s'obtenen mitjançant aparellaments entre germans durant diverses
generacions amb l'objectiu de crear subjectes homozigòtics per a gairebé tots els
loci, de manera que s'obtenen subjectes clònics. Això redueix la variabilitat entre-subjectes
d'una mateixa soca.
-
Les soques consanguínies de rates més utilitzades són Wistar-Kyoto, Wistar-Furth, CDF/Fischer, Lewis o BN/Mcwi.
-
Les soques consanguínies de ratolins més utilitzades són BALB/c, BDA1, BDA2, C57BL/6, C57BL/10 o C3H.
Les soques inbred permeten identificar gens candidats a participar en la regulació d'un tret amb l'avantatge
que es parteix d'una població genèticament idèntica.
Una vegada establertes les soques consanguínies, se'ls fan diferents bateries de tests
fisiològics i conductuals per a veure quines característiques fenotípiques han quedat
fixades en cada soca (secrecions hormonals, activitat cardíaca, proves de memòria,
ansietat, addicció, activitat, etc.). En funció de quins trets es veuen potenciats
o empitjorats en cada soca consanguínia, s'utilitzaran per a avaluar un tret o patologia
determinats.
a) Les soques consanguínies DBA/2 i C57BL/6 com a eines d'estudi psicogenètic
Les soques inbred que s'utilitzen de manera més habitual en psicogenètica són els ratolins BDA/2 i
els C57BL/6, ja que presenten fenotips completament oposats per a alguns trets. Així,
en l'àmbit pràctic aquestes dues soques actuarien com a rosegadors pertanyents a dues
línies de cria selectiva oposades però amb l'avantatge de tenir animals exactament
idèntics dins de cada soca, cosa que permet reduir la variabilitat individual a l'hora
d'analitzar els resultats.
Aquestes dues soques difereixen en capacitat d'aprenentatge, ansietat, exploració
i susceptibilitat al consum de substàncies addictives: els C57BL/6 són més hàbils
en certs aprenentatges, més ansiosos, menys exploradors i més susceptibles a l'addicció.
Amb relació a la conducta addictiva, s'han fet múltiples treballs comparant els genomes
d'ambdues soques i els dels seus recombinants per a buscar gens candidats a participar
en els processos addictius, com els elaborats per Rodríguez i Plomin. Aquests investigadors,
juntament amb altres col·legues (1995 i 1998), van estudiar mitjançant QTL de recombinants
C57BL/6 x DBA/2 els gens implicats en l'addicció a l'alcohol. Les dues anàlisis van
confirmar el pes dels gens situats en els cromosomes 1, 2, 4 i 10 en el consum d'alcohol,
relacionats entre altres amb la codificació de receptors colinèrgics, serotoninèrgics,
enzims participants en el metabolisme de l'alcohol i diversos canals iònics.
3.2.4.Aportacions a la psicogenètica dels animals manipulats genèticament
Les tècniques de manipulació genètica ens permeten comprovar la implicació en un tret
dels gens que altres tècniques han presentat com a candidats (estudis amb mutacions,
amb soques seleccionades, QTL, etc.).
Els animals manipulats genèticament permeten estudiar els mecanismes d'expressió del
gen, la seva participació en el tret o buscar estratègies terapèutiques en cas de
l'estudi de malalties.
Els resultats obtinguts amb aquests animals sempre s'han de comparar amb un grup d'animals
no manipulats genèticament que serveixin de referència (els anomenats wild type en anglès). Aquests grups de control han de tenir les mateixes característiques que
els manipulats quant a edat, dieta, manteniment, etc.
1) Estudis basats en la falta d'expressió d'un gen
El fet de conèixer el genoma d'una espècie i poder eliminar gens permet investigar
quines són les funcions específiques de cada gen i en quin grau participen en l'expressió
d'un o diversos trets.
El knock-out permet estudiar la participació d'un gen en un tret partint de la seva absència.
Això sí, no s'ha d'oblidar que malgrat que silenciem l'expressió d'un gen, hi ha la
possibilitat que es produeixi algun efecte compensatori per part de la resta dels
gens que emmascari l'efecte de l'eliminació del gen.
a) Estudi de l'ansietat mitjançant knock-out
A partir dels resultats obtinguts en estudis de cria selectiva amb les soques SHA
i SLA (vegeu l'apartat 3.2.3.1.a), es va proposar el gen del transportador de la serotonina
com a possible candidat a la regulació de l'ansietat. Per això, alguns investigadors
han decidit silenciar aquest gen per veure com s'expressa l'ansietat en els animals
que no tenen aquest transportador.
Després de generar el knock-out i que s'hagi establert la línia d'animals manipulats, s'ha de valorar l'efecte de
la inactivació genètica amb proves conductuals concretes (p. ex.: camp obert, evitació
activa, laberint elevat, etc.) i comparar la seva execució amb els animals wild type.
En la taula següent es recullen alguns resultats obtinguts silenciant el gen del transportador
de la 5-HT, i també amb altres línies de knock-outs (KO) en relació amb els wild type (WT), en diferents proves d'ansietat (extret de Finn et al., 2003):
|
Gen diana
|
Prova conductual
|
Fenotip del KO enfront de WT
|
|---|---|---|
|
Unitat α1 receptor GABA
|
Camp obert i laberint elevat
|
Sense diferències
|
|
Unitat β2 receptor GABA
|
Camp obert
|
Menys ansietat
|
|
Unitat γ2L receptor GABA
|
Laberint elevat
|
Més ansietat
|
|
Receptor 5–HT1A
|
Camp obert, laberint elevat, exploració d'ambient nous
|
Més ansietat
|
|
Receptor 5–HT1A
condicional
|
Camp obert, laberint elevat, exploració d'ambient nous
|
Sense diferències
|
|
Receptor 5–HT1B
|
Camp obert, laberint elevat, exploració d'ambient nous
|
Menys ansietat en gairebé totes les proves
|
|
Transportador de la 5–HT
|
Transició llum/foscor
|
Més ansietat
|
|
MAO-A
|
Camp obert
|
Menys ansietat
|
|
MAO-B
|
Camp obert i
Laberint elevat
|
Sense diferències
|
|
COMT
|
Transició llum/foscor
|
Sense diferències en mascles
Més ansietat en femelles
|
Aquests resultats mostren que realment hi ha diversos sistemes implicats en l'expressió
de l'ansietat i que fins i tot l'eliminació d'una de les subunitats que forma un receptor
pot alterar significativament aquest fenotip. Alguns d'aquests canvis només s'observen
en un dels sexes.
Curiosament, també es recull el fet que si el subtipus de receptor 5-HT1A es modifica de manera condicional, l'expressió de l'ansietat és igual que la dels
wild type. Aquest estudi va ser elaborat per Gross et al. el 2002, que van aconseguir crear una línia de ratolins en els quals de manera específica
podien manipular el moment d'expressió del receptor 5-HT1A en zones concretes del cervell com l'hipocamp i el còrtex. De manera que es "rescatava"
els ratolins knock-out i es permetia que el gen es tornés a expressar específicament en el còrtex i l'hipocamp,
la qual cosa fenotípicament es traduïa en el fet que la seva execució en proves d'ansietat
era igual que els wild type.
b) Estudi de l'addicció mitjançant el knock-out
Com que la dopamina és el principal implicat en el circuit del reforç, tots aquells
gens implicats en la síntesi de receptors o enzims relacionats amb aquest neurotransmissor
han estat objecte d'estudi. Haile et al. el 2007 van fer una revisió dels efectes de silenciar alguns gens relacionats amb
el sistema dopaminèrgic sobre el consum de cocaïna. Han observat que cada receptor
de la dopamina està relacionat amb aspectes diferents del consum d'aquesta substància,
per exemple, el receptor D1 està implicat en l'activació motriu, el D2 en el reconeixement d'estímuls discriminadors del consum o el D3 en l'establiment d'associacions condicionades al consum.
Actualment, s'està estudiant el paper del receptor dels cannabinoides CB1 en els processos addictius. S'ha observat que els knock-out per al receptor CB1 no desenvolupen condicionament de lloc ni per a la nicotina ni per a l'alcohol, i
que aquests animals consumeixen menys alcohol i menys cocaïna (Castañé et al., 2002; Thanos et al., 2002; Soria et al., 2005).
2) Estudis mitjançant animals transgènics
Els transgènics permeten expressar gens humans associats a un tret o malaltia en altres
espècies animals per tal d'estudiar-los aïlladament. Actualment, s'estudien mitjançant
aquesta tècnica malalties neurodegeneratives com l'Alzheimer o el Parkinson.
Els animals transgènics expressen un gen d'una altra espècie (en aquest cas, de la
humana) amb l'objectiu d'estudiar i caracteritzar l'expressió d'aquest gen. En cas
que el gen estigui associat a alguna patologia concreta, a més de caracteritzar-lo
permet provar noves estratègies terapèutiques.
a) Estudi de tractaments per a malalties neurodegeneratives mitjançant transgènics:
Alzheimer
L'Alzheimer és el tipus de demència més comuna en la població occidental, la característica
histopatològica de la qual és l'aparició de feixos neurofibril·lars i plaques beta-amieloides,
i també un augment en la fosforilació de la proteïna Tau. Se sap que és una malaltia
poligènica (menys la variant precoç, que és monogènica), així que hi ha diverses dianes
genètiques.
El 2005 (Oddo et al.) es va avaluar el potencial terapèutic de la nicotina contra l'Alzheimer, ja que
alguns estudis semblaven indicar que el consum d'aquesta substància podia disminuir
l'agregació de plaques de ß-amieloide. Per a això es van utilitzar els ratolins 3xTg-AD-AD,
que porten el gen promotor de la proteïna amieloide (APPSwe) i el gen humà de proteïna Tau (tau P301L), de manera que aquests ratolins desenvoluparan plaques amieloides i presentaran
nivells alts de proteïna Tau, igual que els humans que presenten la malaltia d'Alzheimer.
Durant 5 mesos se'ls va administrar nicotina en l'aigua que bevien. Després d'aquest
període, van observar que el tractament no havia fet disminuir el nombre de plaques
amieloides, i que de fet havia augmentat els nivells de Tau. D'aquesta manera, van
demostrar que la nicotina no era tan bon agent terapèutic contra aquest tipus de demències.
b) Estudi de tractaments per a malalties neurodegeneratives mitjançant transgènics:
Parkinson
Actualment, s'està començant a estudiar la malaltia de Parkinson mitjançant l'ús d'animals
transgènics que sobreexpressen la proteïna alfa-sinucleïna, una proteïna que s'acumula
a la substància negra en aquesta malaltia (Yacoubian et al., 2007).
-
L'ús d'animals en la recerca psicogenètica aporta nombrosos avantatges a l'hora d'estudiar l'expressió dels trets fenotípics.
-
Els estudis que comparen soques d'una mateixa espècie, mitjançant mutacions espontànies i mitjançant els models animals clàssics, permeten identificar gens concrets implicats en trets/malalties.
- Les soques outbred ens permeten:
-
Observar la distribució d'un tret en una població heterogènia.
-
Estudiar l'efecte sobre un tret de l'ambient compartit enfront de l'efecte del genoma comparant diverses soques.
-
-
Les mutacions espontànies presenten gens candidats a participar en el tret afectat per la mutació.
-
La cria selectiva permet identificar els gens implicats en un tret mitjançant la comparació de dos fenotips oposats per a aquest tret.
-
Les soques inbred permeten identificar gens candidats a participar en un tret a partir d'una població genèticament idèntica.
-
Els estudis amb animals manipulats permeten comprovar la participació d'un gen en l'expressió d'un tret, estudiar els mecanismes d'expressió d'aquest gen i buscar estratègies terapèutiques en cas que el gen es relacioni amb una malaltia.
Exercicis d'autoavaluació
Apartat 1. Mètodes estadístics
1. Una heretabilitat àmplia d'un tret de personalitat del 40% significa el següent:
2. Amb relació a l'heretabilitat estricta, quina de les afirmacions següents no és certa?
3. El nombre de germans dins d'una família i la interacció amb els pares seria un exemple...
4. Si comparéssim la semblança entre dos germans adoptius i trobéssim que en un tret
s'assemblen molt, significaria que...
5. Uns pares amb un CI elevat i una gran passió per la lectura aporten, a més de gens
relacionats amb la intel·ligència, un ambient propici per al desenvolupament primerenc
de les habilitats lectores. Això seria un exemple...
6. La interacció genotip-ambient consisteix en...
7. L'estudi de bessons monozigòtics criats de manera separada és útil perquè...
8. Per estudiar un tret quantitatiu de distribució contínua, en un estudi de famílies,
utilitzaríem...
9. Els estudis de QTL serveixen per a...
10. En els estudis d'associació...
Apartat 2. Mètodes i tècniques de laboratori
11. Volem efectuar una separació electroforètica de dos fragments d'ADN de 300 pb i 292
pb respectivament. Serà millor utilitzar un gel d'agarosa o d'acrilamida? I a quina
concentració aproximada?
12. Analitzem un polimorfisme mitjançant PCR-RFLP en diferents mostres. En la PCR s'obté
un fragment d'ADN de 400 bp, i en tallar-lo amb l'enzim de restricció HhaI es generen
dos fragments de 300 i 100 pb en el cas que hi hagi una citosina (C) en lloc d'una
guanina (G) en una posició determinada de la seqüència. Després de separar els fragments
en un gel d'agarosa, s'obté el patró següent de restricció a les sis mostres:
Quins serien els genotips de les mostres 1-6 per a aquest polimorfisme?
13. Estem interessats a realitzar una cerca de mutacions patogèniques en una sèrie de
pacients. Per a això utilitzem la tècnica d'SSCP, que és un mètode barat i ràpid per
a analitzar cada un dels exons d'un gen. Trobem algunes mostres que presenten un patró
anòmal de bandes en el gel (comparades amb alguns controls sans), mentre que d'altres
presenten un patró normal. Podem afirmar que les mostres amb el patró anòmal són portadores
d'alguna mutació? I les que presenten un patró normal, podem afirmar que no tenen
mutacions puntuals?
14. Seguint amb l'exemple anterior, ens trobem que després de seqüenciar una de les mostres
que presentaven un patró anòmal d'SSCP, obtenim el resultat següent. Pensant que és
un artefacte experimental, repetim la seqüenciació en totes dues direccions, i obtenint
el mateix resultat, què pot passar? Per què a partir d'aquest nucleòtid sembla que
hi hagi dues seqüències superposades?
15. Continuem analitzant altres gens. És possible que hi hagi delecions o duplicacions
exòniques heterozigotes que no es detectin mitjançant seqüenciació directa o SSCP,
així que utilitzem la tècnica de l'amplificació múltiple dependent de sonda. Obtenim
els valors normalitzats següents de l'àrea d'un pic, que correspon a un exó concret
d'aquest gen: control 1 = 1,06, control 2 = 0,91, cas 1 = 1,12, cas 2 = 1,59, cas
3 = 0,56. Creieu que algun dels casos presenta alguna mutació? En cas afirmatiu, concreteu
de quin tipus.
16. Aquest mateix gen que estem estudiant pot presentar un processament alternatiu d'ARN
missatger, la qual cosa dóna com a resultat diverses proteïnes diferents. Aquest processament
podria ser diferent en casos control i en els patològics. Quin experiment faríeu per
testar aquesta hipòtesi?
17. Trobem una mutació situada en el promotor d'un gen en algunes mostres. Quin experiment
podríem realitzar per a saber si té alguna conseqüència funcional?
18. Finalment, es veu que encara que hi ha una alteració en l'expressió total d'aquest
gen, en els casos patològics, aquest fet no està relacionat amb la presència d'aquesta
mutació. Hi ha d'haver algun altre factor que modifiqui l'expressió d'aquest gen.
Podeu proposar alguna hipòtesi?
Apartat 3. Mètodes d'estudi en models animals
19. Les soques outbred...
20. La cria selectiva...
21. Assenyaleu l'opció falsa amb relació a les soques inbred:
22. La tècnica del knock-out es basa en...
23. En un animal transgènic...
24. Assenyaleu l'opció correcta sobre els knock-down.
25. L'avantatge dels animals _____ és que permeten silenciar gens vitals per al desenvolupament
quan eliminar-los no té efectes letals per a l'individu.
26. L'ús de diferents soques d'una mateixa raça per a comparar genomes...
27. En el cas de la cria selectiva, es podria comparar el genotip de les rates RHA i
les ALA?
28. Els ratolins C57BL/6 i els ratolins DBA/2...
29. Respecte a la investigació utilitzant knock-out, indiqueu l'afirmació falsa.
30. Els animals transgènics expressen el gen pertanyent a una altra espècie, la qual
cosa permet...
Solucionari
1.a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Correcte
d.Incorrecte
2.
a.Incorrecte
b.Correcte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
3.
a.Incorrecte
b.Correcte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
4.
a.Correcte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
5.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Correcte
6.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Correcte
7.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Correcte
d.Incorrecte
8.
a.Incorrecte
b.Correcte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
9.
a.Correcte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
10.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Correcte
11.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Correcte
d.Incorrecte
12.
a.Incorrecte
b.Correcte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
13.
a.Correcte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
14.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Correcte
15.
a.Incorrecte
b.Correcte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
16.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Correcte
17.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Correcte
18.
a.Incorrecte
b.Correcte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
19.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Correcte
20.
a.Correcte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Incorrecte
21.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Correcte
d.Incorrecte
22.
a.Incorrecte
b.Incorrecte
c.Incorrecte
d.Correcte
Bibliografia
Bibliografia de l'apartat "Mètodes estadístics"
Andrés-Pueyo, A. (1997). . Madrid: Ed: McGraw-Hill Interamericana.
Bouchard, T. J. i McGue, M. (1981). Familial Studies of Intelligence: A review. ,
212, 1055-1059.
Bouchard, T. J. i McGue, M. (2002). Genetic and environmental influences on human
psychological differences. , 54, 4-45.
Colom, R., Aluja-Fabregat, A., i García-López, O. (2002). Tendencias de emparejamiento
selectivo en inteligencia, dureza de carácter, extraversión e inestabilidad emocional.
Psicothema, 14, 154-158.
DiLalla, L. (2004). . Washington, DC: American Psychological Association.
Gallardo-Pujol, D., García-Forero, C., Kramp, U., Maydeu-Olivares, A., i Andrés-Pueyo,
A. (2007). Iq heritability estimation: analyzing genetically-informative datawith
structural equation models. , 19, 150-156.
García-Forero, C. (2006). Departament de Personalitat, Avaluació i Tractament Psicològic.
Barcelona: Universitat de Barcelona.
Hamer, D. (2002). GENETICS: Rethinking Behavior Genetics. , 298, 71-72.
Hopfer, C. J., Lessem, J. M., Hartman, C. A., Stallings, M. C., Cherny, S. S., Corley,
R. P., Hewitt, J. K., Krauter, K. S., Mikulich-Gilbertson, S. K., Rhee, S. H., Smolen,
A., Young, S. E., i Crowley, T. J. (2007). A genome-wide scan for loci influencing
adolescent cannabis dependence symptoms: Evidence for linkage on chromosomes 3 and
9. , 89, 34-41.
Lander, E. i Kruglyak, L. (1995). Genetic dissection of complex traits: guidelines
for interpreting and reporting linkage results. , 11, 241-247.
Martí i Carbonell, S. i Darbra i Marges, S. (2006). . Bellaterra: Servei de Publicacions
de la Universitat Autònoma de Barcelona.
McGuffin, P., Riley, B., i Plomin, R. (2001). GENOMICS AND BEHAVIOR: Toward Behavioral
Genomics. 291, 1232-1249.
Neale, M. C. i Maes, H. H. (en premsa). Dordrecht, Holanda: Kluwer Academic Publishers
B. V.
Plomin, R., DeFries, J., Craig, I., i McGuffin, P. (2002). . Washington, DC: American
Psychological Association.
Trouton, A., Spinath, F. M., i Plomin, R. (2002). Twins Early Development Study (TEDS):
A Multivariate, Longitudinal Genetic Investigation of Language, Cognition and Behavior
Problems in Childhood. , 5, 444-448.
Weaver, I. C. G., Cervoni, N., Champagne, F. A., D'Alessio, A. C., Sharma, S., Seckl,
J. R., Dymov, S., Szyf, M., i Meaney, M. J. (2004). Epigenetic programming by maternal
behavior. , 7, 847-854.
Bibliografia de l'apartat "Mètodes i tècniques de laboratori"
Bustin, S. A. i Dorudi, S. (2002). The value of microarray techniques for quantitative
gene profiling inmolecular diagnostics. , 8 (6), 269-72.
Chen, X. i Li, Z. (en premsa, 2008). .
Biom J. Clark, S. J., Statham, A., Stirzaker, C., i Molloy P. L. (2006). Frommer M.
DNA methylation: bisulphite modification and analysis. , 1 (5), 2353-64.
Ezquerra, M., Campdelacreu, J., Muñoz, E., Oliva, R., i Tolosa, E. (2004). Sequence
analysis of tau 3'untranslated region and saitohin gene in sporadic progressive supranuclear
palsy. , 75 (1), 155-7.
Jurg, Ott (1991). (edició revisada). Baltimore: Johns Hopkins University Press.
Kovas Y., i Plomin, R. (2006). Generalist gens: implications for the cognitives sciences.
, 10 (5), 198-203.
Kozal, M J., Shah, N., Shen, N., Yang, R., Fucini, R., Merigan, T. C., Richman, D
.D., Morris, D., Hubbell, E., Chee, M., i Gingeras, T. R. (1996). Extensive polymorphisms
observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays.
, 2 (7), 753-9.
Lee, J. E., Choi, J. H., Lee, J. H., i Lee, M. G. (2005). Gene SNPs and mutations
in clinical genetic testing: haplotype-based testing and analysis. , 573 (1-2), 195-204.
Michael W. Pfaffl (Editor: T. Dorak). Relative quantification in: Real-time PCR.
63-82. [Data de consulta: 15-02-08]. http://www.gene-quantification.de/
Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., i Erlich, H. (1992). Specific
enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. , 24, 17-27.
Ravnik-Glavac, M., Glavac, D., i Dean, M. (1994). Sensitivity of single-strand conformation
polymorphism and heteroduplex method for mutation detection in the cystic fibrosi
gene.3 (5), 801-7.
Roberts, R. J. (1981). Restriction and modification enzymes and their recognition
sequences. , 9 (1) r75-96.
Richard, R. (1980). Restriction and modification enzymes and their recognition sequences.
, 11 (8), 197.
Sambrook, J. i Russell, D. W. (2001). . Cold Spring Harbor Laboratory Press, EUA.
Scarciolla, O., Brancati, F., Valente, E. M., Ferraris, A., De Angelis, M. V., Valbonesi,
S., Garavaglia, B., Uncini, A., Palka, G., Stuppia, L., i Dallapiccola, B. Multiplex
ligation-dependent probe amplification assay for simultaneous detection of Parkinson's
disease gene rearrangements. 200, 22 (15), 2274-8.
Schumacher, A. i Petronis, A. (2006). Epigenetics of complex diseases: from general
theory to laboratory experiments. ,
Whitcombe, D., Brownie, J., Gillard, H. L., McKechnie, D., Theaker, J., Newton, CR.,
i Little, S. (1998). A homogeneous fluorescence assay for PCR amplicons: its application
to real-time, single-tube genotyping. , 44 (5), 918-23.
Llista de recursos
A continuació, s'exposen una sèrie de recursos en línia d'utilitat per a obtenir informació
de gens, SNP, mètodes, sistemes estadístics d'anàlisi genètica, etc.
Human Genome Resources. Llista de recursos variats per a accedir a informació de genètica humana: gens,
seqüències, mapes, malalties i polimorfismes, etc.
International HapMap Project. El projecte HapMap posa a disposició dels investigadors tota la informació referent
a centenars de milers d'SNP del genoma humà i el possible desequilibri de lligament
entre ells entre les diferents poblacions.
Restriction mapper. Pàgina amb què es poden buscar enzims que tallin l'ADN en presència d'un polimorfisme
determinat (per a la tècnica de PCR-RFLP).
Societat Espanyola de Genètica. Informació variada sobre cursos, seminaris, conferències, etc. de la Societat Espanyola
de Genètica.
Automated splice analysis, splice view i pupasuite. Pàgines que prediuen probabilitats que un polimorfisme determinat tingui conseqüències
funcionals utilitzant diferents algoritmes.
SNPstats. Anàlisi en línia d'associació genètica per a estudis de cas-control inferint haplotips
a partir dels SNP i ajustant amb covariables.
Primer3: WWW primer tool. Eina en línia amb què podeu dissenyar parells d'oligonucleòtids per a amplificar
un segment d'ADN concret.
De Finetti software. Anàlisi de desviació de l'equilibri Hardy-Weinberg i test per a determinar associació
genètica d'SNP.
Genetic analysis software. Pàgina de la Universitat de Rockefeller en què es recopila tot tipus de programari
lliure per a diferents tipus d'anàlisis genètiques.
Bioinformatics. Gene-Quantification info. Programari i informació relacionada amb la quantificació de l'expressió gènica.
Applied Biosystems - TaqMan® SNP Genotyping Assays - Keyword Search. Pàgina d'Applied Biosystems en què es poden trobar centenars de milers d'assajos
TaqMan, prèviament dissenyats per a genotipar bona part dels SNP coneguts.
Gene Expression Profile Analysis Suite. Plataforma en línia d'anàlisi de microxips d'expressió amb tutorials inclosos per
a la seva utilització.
Bibliografia de l'apartat "Mètodes d'estudi en models animals"
Butt, C. M., Hutton, S. R., Stitzel, J. A., Balogh, S. A., Owens, J. C., i Collins,
A. C. (2003). A polymorphism in the alpha4 nicotinic receptor gene (Chrna4) modulates
enhancement of nicotinic receptor function by ethanol. ., 27, 733-742.
Castane, A., Valjent, E., Ledent, C., Parmentier, M., Maldonado, R., i Valverde, O.
(2002). Lack of CB1 cannabinoid receptors modifies nicotine behavioural responses,
but not nicotine abstinence. , 43, 857-867.
Clemente, I. i Martí-Carbonell, S. (1995). . . Bellaterra: Servei de Publicacions
de la UAB.
Crabbe, J. C., Wahlsten, D., i Dudek, B. C. (juny, 1999). Genetics of mouse behavior:
interactions with laboratory environment. 284 (5420), 1670-2.
De Boer, S. F., van der Vega, B. J., i Colas, J. M. (setembre, 2003). Individual Variation
in Aggression of Feral Rodent Strains: A Standard for the Genetics of Aggression and
Violence? 33 (5), 485-501.
Del Abril Alonso, A., Ambrosio Flores, E., De Blas Calleja, M. R., Caminero Gómez,
A. A., García Lecumberri, C., De Pablo González, J. M., i Sandoval Valdemoro, E. (2005).
Madrid: Editorial Sanz y Torres.
Escorihuela, R. M., Tobeña, A., i Fernández-Teruel, A. (1994). . Bellaterra: Servei
de Publicacions de la UAB.
Fernández-Teruel, A., Escorihuela, R. M., Gray, J. A., Aguilar, R., Gil, L., Giménez-Llort,
L., Tobeña, A., Bhomra, A., Nicod, A., Mott, R., Driscoll, P., Dawson, G. R., i Flint,
J. (12 d'abril de 2002). A quantitative trait locus influencing anxiety in the laboratory
rat., 4, 618-626.
Finn, D. A., Rutledge-Gorman M. T., Crabbe J. C. (abril, 2003). Genetic animal models
of anxiety. 4 (3), 109-35.
Griffiths, A. J. F., Gelbart, W. M., Miler, J. H., i Lewontin, R. C. (2003). . Madrid:
Ed. McGraw-Hill/Interamericana d'Espanya S. A. U.
Gross, C., Zhuang, X., Stark, K., Ramboz, S., Oosting, R., Kirby, L., Santarelli,
L., Beck, S., i Hen, R. (2002). Serotonina receptor acts during development to establish
normal anxiety–like behaviour in the adult. Nature, 416, 396-400.
Haile, C. N., Kosten, T. R., i Kosten, T. A. (gener, 2007). Genetics of dopamine and
its contribution to cocaine addiction. ., 37 (1), 119-45.
Li, R., Faraco, J. H., Lin, L., Lin, X., Hinton, L., Rogers, W., Lowe, J. K., Ostrander,
E. A., i Mignot, E. (maig, 2001). Physical and radiation hybrid mapping of canine
chromosome 12, in a region corresponding to human chromosome 6 p 12-q12. , 73 (3),
299-315.
Manis, J. P. (13 de desembre de 2007). Knock out, knock in, knock down–genetically
manipulated mice and the Nobel Prize. , 357 (24), 2426-9.
Oddo, S., Caccamo, A., Green, K. N., Liang, K., Tran, L., Chen, Y., Leslie, F. M.,
LaFerla, i F. M. (febrer, 2005). Chronic nicotine administration exacerbates tau pathology
in a transgènic model of Alzheimer's disease.A. 102 (8), 3046-51.
Rodríguez, L. A., Plomin, R., Blizard, D. A., Jones, B. C., i McClearn, G. E. (abril,
1995). Alcohol acceptance, preference, and sensitivity in mice. II. Quantitative trait
loci mapping analysis using BXD recombinant inbred strains. , 19 (2), 367-73.
Soria, G., Mendizábal V., Touriño C., Robledo P., Ledent C., Parmentier M., Maldonado
R., i Valverde, O. (setembre, 2005). Lack of CB1 cannabinoid receptor impairs cocaine
self-administration. , 30 (9),1670-80.
Tarantino, L. M., McClearn, G. E., Rodríguez, L. A., i Plomin, R. (agost, 1998). Confirmation
of quantitative trait loci for alcohol preference in mice. , 22 (5), 1099-105.
Thanos, P. K., Dimitrakakis, E. S., Rice, O., Gifford, A., i Volkow, N. D. (2005).
Ethanol selfadministration and ethanol conditioned place preference are reduced in
mice lacking cannabinoid CB1 receptors. ., 164, 206-213.
Varty, G. B, Higgins, G. A. (1994). Differences between three rat strains in sensitivity
to prepolsi inhibition of an acoustic startle response: influence of apomorphine ans
phencyclidine pretreatment. , 8 (3), 148-156.
Vidal, A. (2004). Ratones modificados genéticamente: métodos y aplicaciones en endocrinología
(I). Material del curs "Animales modificados genéticamente como modelos de patología
endocrina". Universitat de Vigo.
Yacoubian, T. A., Cantuti-Castelvetri, I., Bouzou, B., Asteris, G., Malean, P. J.,
Hyman, B. T., i Standaert, D. G. (2007). Transcriptional dysregulation in a transgenic
model of Parkinson disease. , Nov. 28 [Epub ahead of print]
Zhang, S., Amstein, T., Shen, J., Brush, F. R., i Gershenfeld, H. K. (maig, 2005).
Molecular correlates of emotional learning using genetically selected rat lines. .,
4 (2), 99-109.
Zhang, Y., Proenca, R., Maffei, M., Barone, M., Leopold, L., i Friedman, J. M. (desembre,
1994). Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. , 372 (6505),
425-32.